TGFβ2和PPP3CA基因在黔北麻羊性腺轴组织表达及对卵巢颗粒细胞的调控研究

旨在对转录组测序中单羔组对多羔组TGFβ2和PPP3CA基因的上、下调结果进行验证，并探究黔北麻羊TGFβ2和PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞的调控机制。本研究以单、多羔黔北麻羊母羊为试验对象。通过RT-qPCR技术检测TGFβ2与PPP3CA基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴中的表达水平；构建目的基因真核表达载体。培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞，并利用脂质体转染法将pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒导入卵巢颗粒细胞，检测培养基中雌二醇（E2）、孕酮（P4）的浓度。利用CCK-8和Annexin V-FITC法检测TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响。随后，利用RT-qPCR从细胞水平检测超表达TGFβ2、PPP3CA基因对TGFβ2、PPP3CA、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因表达的影响。RT-qPCR结果表明，TGFβ2与PPP3CA基因在被检测的组织中均有表达，且在单羔组中的表达量普遍高于多羔组；免疫荧光法证实，所培养的细胞为黔北麻羊卵巢颗粒细胞；TGFβ2与PPP3CA基因真核表达质粒导入细胞后，在极显著提高TGFβ2与PPP3CA基因表达的同时，能够极显著地抑制卵巢颗粒细胞中FSHR、GnRHR、BMP4、TIMP3基因的表达（P<0.01）。细胞增殖与凋亡结果显示，TGFβ2与PPP3CA基因能够促进颗粒细胞凋亡，抑制其增殖。酶联免疫吸附试验结果表明，TGFβ2与PPP3CA基因能够显著促进E2的分泌，但对P4的分泌无显著影响。本研究成功构建了TGFβ2、PPP3CA基因真核表达载体，荧光定量结果表明，超表达TGFβ2、PPP3CA基因抑制了繁殖相关基因的表达，提示TGFβ2、PPP3CA基因对山羊繁殖相关基因表达有一定的影响。为进一步研究TGFβ2、PPP3CA基因对黔北麻羊繁殖力的影响提供基础数据。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

NCG对山羊性腺轴组织中ITGB8、IGFBP3基因相对表达量的影响

为了探究妊娠早期饲喂N-氨甲酰谷氨酸(N-Carbamylglutamate, NCG)提高山羊产羔数的繁殖机制,试验采用实时荧光定量PCR方法检测了ITGB8、IGFBP3基因在空白组和NCG组(0.15%NCG)卵巢、子宫、输卵管、垂体、下丘脑等性腺轴组织中的相对表达量。结果表明：ITGB8和IGFBP3基因在贵州白山羊5个组织中均有不同程度表达。相同组别不同组织比较,ITGB8基因在空白组的相对表达量为下丘脑>垂体>输卵管>子宫>卵巢,在NCG组的相对表达量为垂体>子宫>下丘脑>输卵管>卵巢;IGFBP3基因在空白组和NCG组中的表达趋势均为子宫>卵巢>输卵管>下丘脑>垂体。相同组织不同组间比较,ITGB8基因在NCG组垂体、卵巢、输卵管、子宫组织中的相对表达量极显著低于空白组(P<0.01),在下丘脑中两组间差异不显著(P>0.05);IGFBP3基因在NCG组垂体、卵巢、输卵管、子宫组织中的相对表达量均极显著低于空白组(P<0.01),在下丘脑中两组间差异不显著(P>0.05)。说...     

GDF9、BMP15基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达研究

为探讨GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴组织中的mRNA相对表达规律,本实验选取产单羔和多羔的经产母羊各3只,通过qPCR法对GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺组织中的相对表达水平进行检测。结果表明：GDF9、BMP15基因mRNA在单、多羔黔北麻羊5个性腺组织中均有不同程度的表达。由组间比较可知,多羔组的GDF9基因在垂体相对表达量极显著高于单羔组,在输卵管中单羔组的相对表达量显著高于多羔组,其他组织之间差异不显著;BMP15基因在输卵管中的表达量呈现为单羔组极显著高于多羔组,在子宫中呈现为单羔组显著高于多羔组,其余组织之间差异不显著。本实验结果表明GDF9基因和BMP15基因在黔北麻羊的单羔组和多羔组性腺轴组织之间的表达趋势大体一致,在卵巢中最高,在子宫中最低,说明2个基因对黔北麻羊的繁殖性能有重要作用。本研究结果可为今后深入探究GDF9基因和BMP15基因对山羊的繁殖机理提供理论依据。     

努比亚山羊同期发情与定时输精方法探究

为探究4种同期发情处理方法在努比亚山羊中的应用效果以及不同处理方法在处理结束后的发情集中时间分布,本实验以冬、春两季234只努比亚山羊为研究对象,采用前列腺素(PG)+PG、海绵栓+PG、海绵栓+孕马血清促性腺激素(PMSG)、海绵栓+PMSG+PG 4种处理方法对其进行同期发情处理,从同期发情率、21 d返情率、24 h同期率、成本等方面对同期发情效果进行综合分析。结果表明:冬季的4个处理中,PG+PG处理同期发情率(89.58%)、21天返情率(18.60%)均略高于其他3种(P>0.05),成本仅为10元/只;4种处理方法发情时间主要集中在处理结束后25～48 h;海绵栓+PG法的同期发情率在春季高于冬季(92.61%>83.33%),21 d返情率则为春季低于冬季(12.77%<13.33%),24 h内同期率更高(72.22%>62.75%),发情时间主要集中在48～72 h。综上所述,PG+PG法更适用于生产实践,海绵栓+PG法可作为其辅助方法参考,最佳定时输精时间在处理完成后25～48 h(冬季)。     

NAC饲喂努比亚山羊对ADCY8、PIK3R2基因在性腺轴组织表达水平研究

为探究N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)对山羊繁殖性能的影响,该试验在前期饲喂0.07%的NAC提高了山羊产仔数的基础上,以努比亚山羊为研究对象,采用q-PCR检测ADCY8、PIK3R2基因在空白组和NAC饲喂组(0.07%NAC)下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织中的表达量变化。结果表明:ADCY8和PIK3R2基因在5个组织中均有表达。ADCY8基因在空白组下丘脑中表达量最高,饲喂组子宫中表达量最高,在卵巢中的表达量均最少,垂体和下丘脑中空白组极显著高于饲喂组(P0.01);PIK3R2基因在空白组和饲喂组中垂体的表达量最高,在卵巢中表达量最少,在垂体和下丘脑中空白组极显著高于饲喂组(P0.01)。综上所述,饲喂0.07%的NAC可能通过上调ADCY8、下调PIK3R2在性腺轴的表达量进而影响努比亚山羊的繁殖性能。