羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

【目的】 为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】 将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】 OrfV样本经60 ℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20 μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35 μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^-1.68 TCID₅₀/0.1 mL。【结论】 本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。     

23株鸭疫里默氏杆菌贵州株的耐药及耐消毒剂基因分析

为指导鸭场防控鸭疫里默氏杆菌(RA)的感染，本研究对23株RA贵州株进行药敏试验，并经PCR对其耐药基因及耐消毒剂基因的携带情况进行检测。结果显示23株RA对氨基糖苷类(链霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那)、大环内酯类(阿奇霉素、红霉素、新霉素)等抗生素均有较强耐药性，菌株耐药率达78.26%以上。对头孢类(头孢氨苄)、氯霉素类(氟苯尼考)等抗生素较敏感，菌株敏感率达69.56%以上。耐药基因检测结果显示，23株RA中，四环素类[tet(X)]、喹诺酮类(oqx A、oqx B)、大环内酯类(ermF)耐药基因检出率达100%(23/23)；氟苯尼考类(flo R)、氨基糖苷类[aph(3’)-Iia、rmt C、cc(6’)-Ib]、β-内酰胺类(blaSHV、blaDHA)、喹诺酮类(qnr A、qnr B)耐药基因检出率分别为82.61%(19/23)、95.65%(22/23)、82.61%(19/23)、73.91%(17/23)、4.35%(1/23)、4.35%(1/23)、17.39%(4/23)、78.26%(18/23)。经分析，23株RA耐药性较强，且最少耐8种...     

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV) B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性，本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域，采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L，通过PCR、双酶切和测序鉴定，结果显示获得1 080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段，测序结果经比对分析正确无误，表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21 (DE3)后经IPTG诱导，SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白，经western blot鉴定，结果显示获得39 ku的单一特异性条带，表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊，采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示，与生理盐水组相比，rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体，并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN...