EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考.[方法]在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MⅡ期卵母细胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况.[结果]在体外成熟液中添加10~20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数(CEI)分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率(59.31%和50.98%)显著高于未添加EGCG的CK组(P<0.05,下同),MⅡ期卵母细胞的GSH含量(3.21和3.25 pmol/枚)也显著高于CK组;添加20~30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MⅡ期卵母细胞的ROS水平.以体外成熟培养获得的水牛MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组.[结论]EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳.     

西藏牦牛卵母细胞蛋白质组表达谱的构建与分析

用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术构建西藏牦牛生发泡(GV)期去透明带卵母细胞的蛋白质组表达谱并进行生物信息学分析。结果显示:共鉴定到550种蛋白质,相对分子质量主要分布在200 000以下,等电点集中在4~12,穹隆蛋白(MVP)是丰度最高的蛋白质;聚类(GO)分析表明:与细胞组分相关的蛋白质主要集中在细胞质(125种),与分子功能相关的蛋白质中发挥多聚A结合RNA功能的蛋白质最多(54种),生物学进程相关的蛋白质中参与内肽酶活性的负调节过程的蛋白质最多(26种);调控通路富集(KEGG Pathway)分析发现,参与的有代表性的通路有补体系统通路,核糖体代谢通路,磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-Akt)信号通路,碳代谢通路等;通过蛋白质互作网络分析,筛选出与网络稳定性关系最密切的10种蛋白质。总之,构建的西藏牦牛GV期卵母细胞蛋白质组表达谱及分析结果,将为探索西藏牦牛卵母细胞成熟机理及关键基因的研究等奠定基础。     

水牛孤雌激活早期胚胎蛋白质表达谱的构建及生物信息学分析

收集水牛孤雌激活后2细胞期早期胚胎500枚,利用0.1%链酶蛋白酶去除透明带后提取蛋白质,并使用胰蛋白酶进行酶解处理,再将酶解得到的多肽混合物经强阳离子交换色谱进行预分离,预分离后所收集的馏分通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术进行质谱鉴定,原始数据通过数据库搜索获得该时期蛋白质表达谱。通过SEQUEST检索共得到778种蛋白,对其进行生物信息学初步分析,包括GO富集分析和蛋白互作网络分析等。结果发现,这些蛋白质主要参与氧化还原、蛋白质折叠、细胞内蛋白质运输等生物学过程,主要定位于线粒体和细胞膜上。本研究为后续以孤雌激活为研究模型探讨哺乳动物早期胚胎发育和母源性蛋白质调控机制提供了新的研究手段和方法。     

水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析

[目的]克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础.[方法]根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况.[结果]水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸.水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近.水牛VIM的分子量为53.73 kD,理论等电点(pI)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主.VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎.[结论]水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段).