柔嫩艾美耳球虫泛素蛋白功能初步研究

泛素是真核生物中普遍存在的一种小分子蛋白,广泛参与细胞内蛋白质的平衡代谢过程,对维持细胞内环境的稳态具有重要作用.为研究泛素在柔嫩艾美耳球虫中的功能,本研究利用PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫泛素(EtUb)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21,诱导表达制备rEtUb蛋白,用纯化的重组蛋...     

宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。