双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp）,结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究。     

成年马来穿山甲饲粮适宜粗蛋白质水平研究

本试验旨在研究饲粮粗蛋白质水平对圈养成年马来穿山甲体重、平均日采食量、粪便评分、血液生化和抗氧化指标及营养物质表观消化率的影响,以确定成年马来穿山甲饲粮适宜粗蛋白质水平。试验采用6×6拉丁方设计,选择6只（雌、雄各3只）体重相近的健康成年马来穿山甲,分别饲喂粗蛋白质水平为40%（Ⅰ组）、42%（Ⅱ组）、44%（Ⅲ组）、46%（Ⅳ组）、48%（Ⅴ组）、50%（Ⅵ组）的试验饲粮。试验分为6个阶段,每个阶段14 d,包括预试期7 d和正试期7 d。结果表明：1）各组之间初重、末重和平均日采食量均无显著差异（P>0.05）。2）各组之间粪便评分和水分含量均无显著差异（P>0.05）。3）各组之间血浆白蛋白、尿素氮、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇含量及丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、脂肪酶活性均无显著差异（P>0.05）,但血浆总蛋白含量存在差异趋势（P=0.060）。4）Ⅲ组的血清过氧化氢酶活性极显著高于Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ组（P<0.01）,Ⅴ组的血清过氧化氢酶活性极显著高于Ⅱ组（P<0.01）,Ⅴ组的血清过氧化氢酶活性显著高于...     

基于光流注意力网络的梅花鹿攻击行为自动识别方法

人工养殖的雄性梅花鹿在发情期间攻击行为剧增,易造成鹿茸损伤,自动监测其攻击行为能为研究减少攻击行为提供重要依据。本文基于注意力机制和长短记忆序列研究了一种光流注意力网络（Optical flow attention attacking recognition network, OAAR）,对梅花鹿的攻击、采食、躺卧、站立行为进行识别。OAAR网络包括前置网络、基础网络和时序网络,前置网络由LK光流算法（Lucas kanade optical flow algorithm）组成,用于提取RGB数据光流信息;基础网络中采用自注意力模块,将ResNet-152网络改造为ARNet152（Attention ResNet-152）,用于将RGB、光流数据集经ARNet152提取特征后输入时序网络;时序网络采用添加注意力模块的长短记忆序列（Attention long short term network,ALST）,并通过分类器输出行为得分和分类结果。视频数据集包括10942段,共310574帧,划分为攻击、采食、站立和躺卧4个大类,攻击行为又划分为撞击、脚踢和追逐3个小类;训练集、验证集和测试集比例为3∶1∶1。研究结果显示,OAAR模型在测试集上正确率为97.45%、召回率为97.46%、F1值为97.45%,ROC曲线中各类识别效果良好,特征嵌入图中各类行为特征区分度较高,各项结果均优于LSTM、双流I3D和双流ITSN网络,具有较好的泛化能力和抗干扰性。在本研究算法基础上集成的鹿只行为自动识别采集系统,为提高梅花鹿养殖生产管理水平和生产效率提供了技术基础。     

外源褪黑素对鹿茸软骨细胞生长发育的影响

试验旨在探讨褪黑素对体外培养的鹿茸软骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。利用甲苯胺蓝、茜素红S、阿利新蓝染色鉴定软骨细胞,采用外源添加褪黑素的方法,用不同浓度（0、400、800、1 200、1 600和2 000 pg/mL）、不同时间（24、48和72 h）处理鹿茸软骨细胞,CCK-8法检测细胞增殖。选取800 pg/mL褪黑素处理软骨细胞24 h,利用流式细胞仪检测细胞周期的分布及细胞凋亡情况,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中睾酮含量。结果显示,经不同浓度的褪黑素处理鹿茸软骨细胞不同时间后,800 pg/mL褪黑素处理鹿茸软骨细胞24 h细胞活力极显著增加（P<0.01）。软骨细胞经褪黑素处理后,与对照组相比,褪黑素处理组细胞G1期比例显著降低（P<0.05）;G2期比例极显著增加（P<0.01）,细胞被阻滞在G2期;褪黑素处理组细胞早期凋亡率无显著变化（P>0.05）,晚期凋亡率显著下降（P<0.05）;ELISA检测睾酮分泌水平均显著上升（P<0.05）。综上,外源添加800 pg/mL褪黑素可以促进鹿茸软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的晚期凋亡,促进睾酮的分泌;以上结果可为阐明褪黑素参与鹿茸生长发育机制提供参考。     

3种去势疫苗的构建及稳定性研究

【目的】试验旨在构建不同种类的新型免疫去势DNA疫苗，分别为KISS1、神经激肽B(NKB)单表达基因疫苗和促性腺激素释放激素(GnRH)、KISS1和NKB 3个基因共表达的三表达基因疫苗，注射到动物体内后能激发免疫反应，产生相应的抗体，从而达到通过调控生殖轴来降低雄激素的目的。【方法】选取下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic pituitary gonadal axis)上的GnRH及其上游调控基因KISS1和NKB作为靶标，并引入平衡致死系统代替抗生素筛选构建重组质粒，其中三表达重组质粒借助2A肽的自剪切功能使目的基因共表达。将重组质粒转染293T细胞后提取细胞RNA,验证其能否在机体内正常表达，随后将构建成功的质粒电转到减毒猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis)C500感受态细胞中，获得重组活菌疫苗，构建的工程菌在体外连续传代50次，选取第0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究。【结果】重组质粒pVAX-2A/KISS1-asd、pVAX-2A/S-NKB-asd和pVAX-S/GnRH-2A/S-NKB-2A/KISS...