Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化简

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件,筛选最佳siRNA干扰片段,进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默,为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy,AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells,RTECs）,并以脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质,将Smurf2 siRNA转染入RTECs;通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件,转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响;同时,用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine ^TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时,转染效率最高,为70%～80%;Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显;与正常组相比,转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件,其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。     

不同剂量链脲佐菌素及不同性别大鼠糖性白内障模型的比较研究

本试验旨在研究不同剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)及不同性别在建立大鼠糖性白内障模型方面的差异。将65、70和75 mg/kg 3个浓度STZ通过一次性腹腔注射建立雌、雄性大鼠糖性白内障模型,36 h后尾静脉采血测血糖,3周后进行裂隙灯检查,每天测量动物饮食量及排粪尿量变化,每周测定体重。试验结果显示,70 mg/kg STZ比65 mg/kg STZ糖性白内障发生时间缩短约1周,且比75 mg/kg STZ死亡率低。同浓度STZ腹腔注射后雌性大鼠糖尿病发生时间为72 h,雄性大鼠为36 h,白内障发生时间雌性比雄性大鼠慢约1周。试验结果表明,腹腔注射70 mg/kg STZ在糖性白内障模型建立所需时间及模型稳定性等方面具有优势,雄性大鼠较雌性更易于建立糖性白内障模型。     

Dab2在马兜铃酸肾病小鼠肾脏中的表达变化

本试验旨在研究Dab2蛋白在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy,AAN）小鼠模型中的表达变化。在AAN小鼠模型的基础上,利用免疫组化、荧光定量PCR和Western blotting技术对肾脏中Dab2基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示,随着用药时间的延长,肾脏组织损伤程度加重;Dab2蛋白表达量在第6天先降低（P＞0.05）,在第12天突然升高随后又极显著降低（P＜0.01）,Dab2蛋白表达总体呈上升趋势,Dab2基因转录水平变化趋势与此一致;同时Dab2蛋白的定位也发生了变化,完成了从刷状缘到细胞质,再到细胞核的转移。结果表明Dab2蛋白参与AAN小鼠的发病过程,为进一步研究Dab2蛋白在AAN中的作用奠定理论基础。     

马兜铃酸肾病中相关因子的表达变化

本研究旨在探讨马兜铃酸肾病（AAN）中标志性因子的表达变化。30只小鼠灌胃8 mg/(kg·d) 马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ),于不同时间处死,用常规病理切片染色法观察肾脏不同时间段的病理变化程度,以实时荧光定量PCR和Western blotting检查各组小鼠肾组织细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、角蛋白18（CK-18）、波形蛋白（vimentin）的表达变化。结果显示随着AAⅠ用药时间的延长,肾脏损伤逐渐加重,并证实AAⅠ可诱导小鼠肾脏发生上皮-间质转分化(EMT),促进α-SMA、vimentin的mRNA及蛋白表达增加,抑制CK-18的表达,为AAN更深一步的机制研究提供有力的理论基础。     

4种方法建立大鼠糖性白内障模型的比较研究

试验旨在研究D-半乳糖饲喂及D-半乳糖、葡萄糖和链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射4种方法能否成功建立大鼠糖性白内障模型,并在此基础上探讨各种方法的优缺点,以期找出一种快速、有效、安全性高、实用性及可重复性强的大鼠糖性白内障模型建立方法,并为犬糖性白内障模型建立提供理论依据。本试验采用D-半乳糖饲喂(日粮30%)及50% D-半乳糖(15 g/kg)、50%葡萄糖(15 g/kg)和STZ(70 mg/kg)腹腔注射4种方法对同日龄大鼠进行模型建立,试验周期为30 d,给药48 h后尾静脉穿刺测定血糖,72 h后用裂隙灯检查晶状体变化情况,每隔3 d测定体重变化,同时每天测定饮水量及摄食量。试验结果显示,D-半乳糖饲喂组晶状体无异常变化;D-半乳糖腹腔注射组和葡萄糖腹腔注射组血糖始终未达到糖尿病血糖标准,但均在第3天可见白内障发生;STZ腹腔注射组在72 h动物出现糖尿病症状,4~5周诱发白内障。结果表明,D-半乳糖饲喂不能使大鼠产生白内障;D-半乳糖腹腔注射及葡萄糖腹腔注射仅需3 d即可诱发白内障,快速且成模率高,适合进行白内障药物延缓效应的研究;STZ腹腔注射需4~5周建立糖性白内障模型,因而更适用于研究糖性白内障的发病机制。     

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。     

连翘酯苷诱生干扰素-γ对AAⅠ诱导的RTECs转分化的影响

体外培养小鼠RTECs,将其随机分为6组,CCK-8法测连翘脂苷对RTECs的增殖率及存活率的影响,ELISA检测转化生长因子β1（TGF-β1）和干扰素-γ的含量,RT-PCR和Western blot检测CK18和Smad7等相关因子的表达变化。结果显示连翘酯苷质量浓度为160mg/L以下对RTECs无毒性,且诱生干扰素2.392μg/L;用药E组与模型B组比较TGF-β1表达显著下降（P〈0.01）;用药组与模型组相比Smad7mRNA极显著高表达（P〈0.01）、CK18mRNA显著高表达（P〈0.05）,而vimentin、α-SMA mRNA抑制表达（P〈0.01）;Western blot结果表明上调了Smad7的表达量。试验表明连翘脂苷可以提高Smad7的表达量,阻止Smad2/Smad3磷酸化,抑制TGF-β1/Smads信号通路,有效改善AAI诱导的肾小管上皮细胞转分化。