小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

为了探讨并完善小鼠骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)的原代分离培养技术,试验通过对SCs的取材、分离、消化、培养等步骤的改进获得SCs,并应用差速贴壁法进行纯化,从形态学、生长曲线、克隆形成能力、冻存复苏活力、SCs表面标记物的检测、成肌细胞分化能力及RT-PCR鉴定等方面对SCs进行研究。结果表明:分离获得的小鼠骨骼肌SCs呈梭形或纺锤形,细胞饱满且折光性强,生长曲线呈标准的"S"型,克隆形成率高达(56.11±1.73)%,冻存复苏后细胞活率为(96.67±0.87)%,表达desmin、c-Met、Myf5、Myo D等SCs表面特异性标记物,成肌细胞诱导分化后能形成多核肌管并表达成肌细胞表面特异性标记物Mylpf。说明小鼠骨骼肌SCs体外培养获得成功。     

牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因的筛选及定量检测

卵母细胞成熟和母源型-合子型过渡过程中,存在大量基因的表达差异,使得应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)筛选对胚胎发育起关键作用的基因成为可能。为了解牛卵母细胞成熟过程及体外受精胚胎不同发育阶段相关基因mRNA表达规律,本研究以牛生发泡(GV)期卵母细胞、体外受精获得的8细胞期胚胎和囊胚期胚胎为检测对象,利用mRNA差异显示技术筛选这三个时期mRNA表达差异基因,并用实时定量PCR分析差异基因在这三个时期以及体外成熟卵母细胞中的mRNA丰度。结果成功筛选得到5个差异片段,经测序和GenBank数据库比对分析,检索到与这5个片段有高同源性的已知基因,分别为无机焦磷酸1基因(PPA1)、ErbB2互作蛋白基因(ERBB2IP)、350kD中心体相互作用蛋白基因(CEP350)、核糖体蛋白L27a基因(RPL27A)和Ⅱ类主要组织相容复合物下调因子基因(IK),实时定量PCR检测和SPSS统计分析结果表明,PPA1、ERBB2IP和CEP350mRNA表达量随胚胎发育进程呈不同程度的降低趋势,RPL27AmRNA表达量在囊胚期由降低转为升高,IK的转录物含量在囊胚期前呈波动变化,到囊胚期显著降低。本研究结果为进一步了解卵母细胞成熟对后续胚胎发育的影响以及合子基因组激活机制提供了实验依据。     

牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养

【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）和牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast,BEF）,用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA 表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞成骨分化比较

本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。     

国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义.本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据.用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验.结果显示,当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5～10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体.结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞.