硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

【目的】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10 ⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8 μmol·L ^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。 【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.01）。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L ^-1 的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05）; S . aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）; S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L ^-1 和8 μmol·L ^-1 硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。 【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。     

金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路和相关修复因子的影响

采用金黄色葡萄球菌侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞,观察该病原菌对乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白和相关修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达的影响。金黄色葡萄球菌以MOI=1∶1的比例接种奶牛乳腺上皮细胞,分别作用0,15,30,45,60,120,240 min,采用Western blot法检测乳腺上皮细胞β-catenin、Cyclin D1及c-Myc蛋白表达水平;免疫荧光法检测β-catenin的表达及核易位;荧光定量PCR检测EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达。结果显示,β-catenin蛋白在45,60,120 min表达量升高,与0 min相比差异显著(P<0.05);Cyclin D1蛋白在45,60,120和240 min表达量升高,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01);c-Myc蛋白在15,30,60,120,240 min表达量升高,差异极显著(P<0.01)。修复相关因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA的表达量在30 min均出现极显著升高(P<0.01),且VEGF基因mRNA在45,60,120和240 min均呈现极显著升高(P<0.01),EGFR基因mRNA表达量在30,45和60 min时表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺上皮细胞后,诱导Wnt/β-catenin信号通路的转导和修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因转录,该信号通路和修复因子可能参与金黄色葡萄球菌导致的炎症和细胞损伤的修复过程。     

羊瘤胃切开术的适应症及方法

瘤胃切开术主要适用于牛、羊等反刍动物前胃疾病及瓣胃阻塞、皱胃阻塞、创伤性网胃炎、腹膜炎等,术时要严格无菌要求。本文对瘤胃切开术的适应症及方法进行讨论,为治疗羊的瘤胃疾病提供参考。     

不同品种绵羊和山羊主要先天性免疫指标的比较

对4个山羊品种和4个绵羊品种的7项主要先天性免疫学指标进行了检测并比较。对动物进行颈静脉采血,制备血清,用ELISA试剂盒测定IL-1、IL-2、IL-6、IL-18、IFN-γ、NK细胞、血清溶菌酶。利用生物统计学的方法和原理,以品种和品种来源地为应变量对检测结果进行比较分析。结果表明,山羊当地品种的NK和LYS高于引进品种（P〈0.05）;绵羊引进品种的IL-1、IL-2、IL-6、IL-18、IFN-γ、NK、LYS均明显高于地方品种（P〈0.01）。在不同品种之间,莱芜黑山羊NK和LYS水平高于崂山奶山羊、波尔山羊和鲁波山羊,萨福克羊的IL-1、IL-6、IL-18、IFN-γ、LYS水平最高且差异极显著（P〈0.01）。小尾寒羊IL-18、IFN-γ水平最低且差异极显著（P〈0.01）。说明不同种群绵羊、山羊的先天性免疫水平存在显著差异,为以后抗病育种提供合理的试验数据。