地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

本试验旨在通过异源表达获得地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CP-16的脂类水解酶,并探究其在羽毛降解过程中的作用。试验以地衣芽孢杆菌CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因,转化入大肠杆菌中表达,获得重组酶L-4。研究重组酶L-4的适宜p H、p H稳定性、适宜温度、温度稳定性以及有机溶剂和金属离子对其相对活性的影响,同时探究其对角蛋白酶K水解天然羽毛角蛋白的作用。结果显示,获得的脂类水解酶基因大小为747 bp,编码248个氨基酸,在大肠杆菌中成功表达出重组酶L-4,其分子质量约为28.3 ku,酯酶活性为0.42 U/m L,适宜p H为6.5,适宜温度为50℃;在p H 6.5~9.5条件下处理30 min相对活性保持80%以上,在低于50℃温度条件下处理30 min相对活性保持70%以上。二价铁离子(Fe~(2+))、钠离子(Na~+)、锰离子(Mn~(2+))、钙离子(Ca~(2+))对重组酶L-4相对活性具有激发作用,钡离子(Ba~(2+))、锌离子(Zn~(2+))、铜离子(Cu~(2+))、镍离子(Ni~(2+))对重组酶L-4相对活性具有抑制作用。当有机溶剂浓度为30%时,重组酶L-4在二甲基亚砜(DMSO)和甲醇中保存97%和85%的相对活性,在丙酮、乙醇中保存45%以上的相对活性,在异丙醇中保存不到20%的相对活性,而在乙腈中相对活性基本完全丧失。用重组酶L-4预处理天然羽毛底物,可提高角蛋白酶K对底物的水解效率,促进率为4.32%。由此可见,脂类水解酶可降解羽毛表层脂质,可在促进角蛋白酶水解羽毛角蛋白中发挥作用。     

植物角质降解菌的种属鉴定、发酵条件优化及酶学性质研究

本试验旨在通过角质降解菌株X8P的种属鉴定、发酵条件优化和酶学性质研究,探讨降解植物表面角质层,进一步改善动物对植物纤维利用的可能新方案。试验通过形态观察和16 S r DNA测序鉴定菌株X8 P种属,并对其产酶所需碳源、氮源、发酵温度与时间进行优化,其发酵液经硫酸铵盐析沉淀获得其胞外蛋白粗酶,并对其粗酶催化的适宜p H和p H稳定性、温度和温度稳定性,以及有机溶剂、表面活性剂和金属离子对其活性的影响进行研究。结果表明:1)菌株X8P经形态观察和分子鉴定为东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)。2)菌株X8P适宜产酶发酵条件为溶菌肉汤(LB)培养基中37℃发酵4 d,1%橄榄油和1%葡萄糖明显促进菌株产酶,而1%可溶性淀粉明显抑制菌株产酶。3)该菌株胞外粗酶催化适宜p H和温度分别为6.5和45℃,且表现出一定p H稳定性,但在有机溶剂中不稳定,仅甘油中可保留全部活性,在二甲基亚砜(50%)中活性可保留66%。吐温(Tween)-20(1 mmol/L)、Tween-80(1 mmol/L)和聚乙二醇辛基苯基醚(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高3%~35%。金属离子钾离子(K+)、锰离子(Mn2+)(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高2%~20%。由此可见,菌株X8P具有一定的产角质酶潜力和应用前景,可进一步深入研究。