基于转录组学和代谢组学研究调控驴背最长肌嫩度的分子机制

旨在基于转录组与代谢组联合分析,探究驴肉嫩度的分子调控机制.本研究以30头生长环境和饲养条件相同、33～36月龄的雌性广灵驴为研究对象,进行剪切力和肌内脂肪含量的测定.依据剪切力和肌内脂肪含量选择出8头驴并将其分为高嫩度组(HT,n=4)与低嫩度组(LT,n=4),通过转录组和代谢组分析筛选差异表达基因和差异代谢物,之...     

广灵驴CAPN1基因克隆、生物信息学分析及表达研究

本研究旨在对钙蛋白酶1（CAPN1）基因CDS区进行克隆及生物信息学分析，并鉴定其在广灵驴各组织中的表达量。应用生物信息学方法对广灵驴CAPN1基因CDS区进行序列分析，并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰结构和蛋白结构进行预测；利用实时荧光定量PCR技术对CAPN1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达水平进行分析。结果显示，广灵驴CAPN1基因CDS区全长2 148 bp，可编码715个氨基酸，已提交至NCBI，登录号为：MN158194，其核酸序列与马、绵羊、牛、人、山羊、小鼠、猪的同源性分别为99.7%、92.3%、92.5%、92.0%、92.5%、85.9%和92.9%；CAPN1蛋白的分子质量为82.01 ku，理论等电点为5.59，平均疏水性为-0.374，不稳定系数为36.42，不存在跨膜区及信号肽；其编码蛋白的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链组成；CAPN1基因在广灵驴的6种组织中均表达，其中在背最长肌中的表达量最丰富，其次是肝脏，在心脏中的表达最低。本研究成功克隆了广灵驴CAPN1基因CDS，并对其在不同组织中的表达量进行了分析，为进一步研究CAPN1基因在肌肉嫩度方面的表达调控功能及发展地方品种广灵驴肉制品产业提供了理论依据。     

广灵驴HSL基因克隆、序列分析与差异表达

试验旨在对广灵驴的激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase，HSL）基因进行克隆和序列分析，并对HSL基因在广灵驴不同组织中的差异表达水平进行分析。使用RT-PCR法扩增并克隆广灵驴HSL基因CDS区部分序列，将序列拼接后得到HSL基因完整的CDS区全长序列，并对序列进行一系列生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR检测HSL基因mRNA在广灵驴的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪7个组织中的表达情况。结果显示，广灵驴HSL基因完整的CDS区全长为2 286 bp，共编码761个氨基酸，序列已提交到NCBI，登录号：MN231003。广灵驴HSL基因的核苷酸序列与马、羊驼、骆驼、猪、牛、山羊、小鼠、绵羊相应序列的同源性分别为99.6%、88.9%、88.6%、88.1%、86.9%、85.6%、80.8%、79.1%。系统进化树预测表明，广灵驴HSL基因与马的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现，HSL蛋白的理论等电点为6.51，不稳定指数为56.83，亲水性的总平均值为-0.048，说明HSL是酸性不稳定的水溶性蛋白。蛋白保守域中存在N-末端结构域、α/β水解酶折叠结构域以及调节结构域。蛋白序列中共存在88个磷酸化修饰位点、25个糖基化修饰位点。蛋白中存在较强的疏水性区域，没有信号肽及跨膜区域。二级结构显示此蛋白是由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成的，分别占45.33%、11.70%、5.65%、37.32%。实时荧光定量PCR检测结果显示，HSL基因mRNA在广灵驴的7种组织中均有表达但存在差异，在皮下脂肪中表达量最高，在心脏中表达量最低，说明广灵驴HSL基因可能在体内脂肪沉积中发挥着非常重要的作用。该试验为进一步研究HSL蛋白功能及其在广灵驴脂肪沉积中代谢调控机制提供了理论基础。     

广灵驴ADSL基因克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinatelyase，ADSL）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在不同组织中的表达情况，为探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成中的作用机制提供理论参考。根据GenBank中公布的马（登录号：XM_001917207.5）、牛（登录号：NM_001102377.2）、猪（登录号：GU249574.1）等物种的ADSL基因mRNA序列，通过Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物，RT-PCR法扩增并克隆ADSL基因序列，对编码序列进行结构与功能分析，最后用实时荧光定量PCR检测ADSL基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌组织中的表达水平。结果显示，广灵驴ADSL基因CDS长1 473 bp，编码490个氨基酸，提交至NCBI，登录号：MW037837，其核苷酸序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的相似性分别为99.5%、90.8%、92.3%、90.4%、90.7%、90.5%和86.0%。进化树分析结果表明，广灵驴与马的种属关系最近，与小鼠的亲缘关系最远。ADSL蛋白分子质量为55.44 ku，等电点为6.52，平均疏水指数为-0.243，是一种不稳定的酸性亲水蛋白。ADSL蛋白有41个磷酸化修饰位点，6个糖基化修饰位点，没有信号肽和跨膜结构，有1个卷曲螺旋。ADSL蛋白主要定位在细胞质，α-螺旋（68.98%）是主要的二级结构。ADSL基因在广灵驴6个组织中都有表达，其中肺脏中的表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05），其次是心脏和肝脏，脾脏、肾脏和背最长肌中的表达量最低。本研究结果为今后探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成的分子机制奠定基础。     

广灵驴ADD1基因的克隆和序列分析与组织表达

运用RT–PCR方法，克隆广灵驴的ADD1基因的CDS区，对其进行序列分析，并通过qRT–PCR技术鉴定ADD1基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌中的相对表达水平。结果表明：广灵驴ADD1基因完整的CDS序列全长为2 223 bp，可编码740个氨基酸，序列已提交到NCBI，登录号为MN_166472，其核苷酸序列与马的核苷酸序列的同源性最高，达99.6%；生物信息学预测ADD1蛋白为结构稳定的亲水性蛋白，理论等电点为5.58，二级结构主要以α–螺旋和无规则卷曲为主，存在1个Ⅱ类醛缩酶和内收蛋白N端超家族结构域，该蛋白没有信号肽及跨膜区域，主要定位在细胞核中，序列中共存在88个磷酸化位点，69个O–糖基化位点和3个N–糖基化位点；实时荧光定量检测结果表明，ADD1基因在广灵驴的6种组织中均有表达，但存在差异，在背最长肌中表达量最丰富，在肝脏中表达量最低。     

广灵驴DGAT2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）基因进行克隆，生物信息学分析和检测其在不同组织中的表达情况，为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳脂率等方面的作用机制提供理论参考。根据GenBank上公布的马（登录号：XM_023645689.1）、双峰驼（登录号：XM_010973154.1）、绵羊（登录号：XM_027979550.1）等物种的DGAT2基因mRNA序列，利用Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物，应用RT-PCR法扩增DGAT2基因序列，用生物信息学方法分析DGAT2基因编码序列，用实时荧光定量PCR技术检测DGAT2基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、肌间脂肪、皮下脂肪组织中的表达。结果显示，广灵驴DGAT2基因CDS序列1 086 bp，编码361个氨基酸，提交到GenBank，获得登录号：MT993643，其编码序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的同源性分别为99.0%、92.0%、93.5%、92.0%、92.7%、85.3%、84.1%。系统进化树分析表明，驴与马的亲缘关系最近，和小鼠的关系最远。DGAT2蛋白分子质量40.96 ku，脂肪系数92.85，等电点9.16，是一种具有跨膜区的稳定碱性疏水蛋白。DGAT2蛋白有28个磷酸化修饰位点，2个糖基化修饰位点，没有信号肽，主要定位在内质网，α-螺旋（39.89%）和无规则卷曲（36.01%）是主要的二级结构。DGAT2基因在检测的8个组织中都有表达，其中皮下脂肪中的表达量显著高于其余组织（P<0.05），其次是心脏、肝脏和肾脏，背最长肌中的表达量最低。本试验结果为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳品质性状的作用奠定基础。     

驴肌内脂肪沉积关键调控因子研究

旨在基于转录组（RNA-Seq）和代谢组（UPLC-MS/MS）关联分析，筛选驴肌内脂肪沉积的关键调控因子。本研究选用饲养条件相同、平均体重为236.10 kg的雌性广灵驴30头，对其背最长肌进行肌内脂肪（IMF）含量的测定，选择年龄一致的驴，并根据其IMF含量的高低分为两组：低肌内脂肪组（L组，每组3头）与高肌内脂肪组（H组，每组3头），进行转录组学和代谢组学测序分析，对差异表达基因（DEGs）和差异代谢物（DAMs）进行KEGG关联分析和相关性分析，并构建相关性网络图。结果表明，在L组和H组之间共鉴定出72种差异代谢物，其中27种代谢物上调，45种代谢物下调；关联分析表明，在差异表达基因和差异代谢物之间共有35条共富集通路，其中甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成5条通路与IMF沉积相关，有8个差异表达基因和15种差异代谢物在这5条通路中富集，包括DGKA、DGAT2、PLA2G3、GPCPD1和SCD等差异表达基因以及甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P）、溶血卵磷脂酸16：0（lysophosphatidic acid，LPA）、溶血卵磷脂酰胆碱16：0（lysophosphatidylcholine，LPC）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）等差异代谢物。另外，通过网络图分析发现，甘油脂代谢通路和甘油磷脂代谢通路中的DGAT2、PLA2G3、GPCPD1和DGKA基因与它们相应的代谢产物具有高度相关性。本研究所鉴定差异表达基因可作为IMF沉积相关的潜在候选基因，为今后进一步探究驴IMF沉积的分子调控机制和驴的肉品质分子育种提供理论依据。