子宫内膜中TLR4的定位及pcDNA3.1-TLR4载体的构建

试验旨在研究TLR4(Toll like receptor4)蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表达,从而构建TLR4真核表达载体,为TLR4在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.选择早期妊娠绵羊(9d、13d、17d、21d、25d)子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测各阶段子宫组织中TLR4蛋白的分布与表达,确定受体蛋白的表达部位.同时将构建的pcDNA3.1-TLR4质粒转染到确定的受体细胞,检测TLR4蛋白的表达水平.结果表明:TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且第17d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR4蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建pcDNA3.1-TLR4表达载体,为TLR4在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.     

绵羊胚胎附植过程中相关因素的研究

胚胎附植属于哺乳动物重要的生殖生理过程,是妊娠建立的标志和重要环节。早期胚胎发育、母体妊娠识别、胚胎附植和妊娠维持都严格依赖于母—胎间复杂的信号传导及关联。大量研究证明,在绵羊胚胎附植过程中,来源于胚胎、母体子宫及宫外组织的多种生殖激素、粘附分子、细胞外基质、细胞活素物质和生长因子均可通过期间精密的调控关系参与并维持孕体的发育、子宫内膜的重塑、分泌功能及子宫生长。这对胚胎附植分子调控信号的掌握以及引起妊娠失败因素的诊断确定提供了参考,从而可提高家畜和人类的妊娠率。本文就绵羊胚胎附植迁移的过程及影响附植的相关因素进行了综述。     

脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响

试验旨在探讨脂多糖（LPS）对绵羊胚胎附植期Toll样受体4（TLR4）及相关免疫因子表达的影响。以构建好的pcDNA3.1-TLR4过表达载体转染绵羊子宫内膜基质细胞,运用Western blotting技术鉴定细胞转染效果,然后用1 μg/L LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。将经LPS处理的细胞分别培养12、24、48、72 h,采用实时荧光定量PCR技术和Western blotting法检测内膜基质细胞中TLR4 mRNA及蛋白表达量,以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平,并以未经LPS处理的细胞作为对照。结果显示,与对照组相比,LPS促进了免疫因子IL-1β、IL-6的释放量,但随LPS作用时间的延长,细胞中IL-6的表达量逐渐下降,而IL-1β的表达量逐渐升高,使得Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向表达;TLR4 mRNA相对表达量在12、24、72 h均显著高于对照组（P<0.05）,48 h时极显著高于对照组（P<0.01）,且LPS处理后的细胞TLR4蛋白表达量也始终高于对照组。综上所述,pcDNA3.1-TLR4过表达载体成功转入绵羊子宫内膜基质细胞;LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路,并促进了下游因子的表达;子宫蜕膜组织中TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持也起到了重要作用。     

TLR4基因在绵羊不同生理状态下子宫内膜组织中的mRNA表达

为了研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在绵羊胚胎附植期和发情周期子宫内膜中mRNA的表达模式。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR分别检测妊娠21 d母羊全身组织和妊娠9、13、17、21、25 d的母羊子宫内膜组织TLR4基因的表达以及绵羊卵泡期与黄体期母羊子宫内膜组织TLR4基因的表达。结果表明,TLR4基因在肝脏、脾脏、卵巢、输卵管、子宫、小肠、膀胱、肌肉及松果体等组织出现表达,其中在输卵管、卵巢、子宫、膀胱、脾脏及松果体中表达量较高,在肝脏、小肠、肌肉中表达较弱,而在心脏、垂体、脂肪等组织中不表达。从妊娠9 d开始,绵羊胚胎TLR4基因表达量呈逐渐下降趋势;至胚胎附植点17 d,TLR4基因表达量最低,之后又呈现上升趋势,到25 d达到峰值。不管是在细毛羊还是在湖羊子宫内膜组织中检测,TLR4基因黄体期的表达水平均显著高于卵泡期(P 0. 05)。说明TLR4的mRNA表达具有组织特异性,在胚胎附植期绵羊子宫内膜中呈现先低后高的趋势,以及其在绵羊发情周期中表达出现黄体期显著高于卵泡期现象,也初步说明了TLR4可能在胚胎附植早期和发情周期中均发挥一定作用。