猪BPI蛋白重组载体的构建及真核表达

试验旨在构建猪BPI真核表达载体,获得猪源BPI重组蛋白.根据GenScript's CloneEZ^® PCR Cloning Kit试剂盒,将BPI编码序列克隆至pUC57载体上,酶切与测序鉴定无误后,将重组质粒pUC57-BPI转染293-6E细胞,并利用SDS-PAGE和Western blotting方法检测其表达水平.结果显示,本试验成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI,并在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达.该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能以及猪抗菌蛋白的制备提供了试验基础.     

胎次、产仔月份及纯繁/杂交对母猪产仔性能的影响

本研究统计分析了部分非遗传因素(胎次、产仔月份及纯繁/杂交)对长白、大白和杜洛克母猪产仔性能(总产仔数、产活仔数及初生窝重)的影响,旨在为后备母猪的选种提供指导。结果表明,2~5胎仔猪的初生窝重较重;其中2、3胎的初生窝重极显著高于头胎及6胎之后的仔猪初生窝重(P<0.01)。3月份总产仔数、产活仔数及初生窝重极显著高于其他月份(P<0.01),且11月份初生窝重显著低于其他月份(P<0.05)。长白纯繁母猪在产活仔数方面极显著优于大白纯繁母猪和长白×大白杂交母猪(P<0.01);在初生窝重方面,大白×长白杂交母猪的初生窝重极显著高于大白纯繁母猪和长白×大白杂交母猪(P<0.01)。第2胎与3~4胎、第3胎与第4胎的总产仔数呈极显著正相关(P<0.01)。综上所述,该猪场母猪3~6胎的产仔性能较好,且以1~4月份的产仔性能为佳;配种方式以长白纯繁和大白×长白杂交为宜;第2胎产仔性能可作为后备母猪选留的重要依据。     

大白猪肿瘤坏死因子α基因启动子区多态性及其对mRNA表达水平的影响

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)基因在机体固有免疫和炎症反应中发挥重要作用,本研究旨在分析大白猪TNF-α基因启动子区C-791T多态性及其与基因表达之间的关系,为分析TNF-α基因启动子区C-791T突变的遗传学效应提供科学依据.本试验利用PCR-SSCP方法对201头大白猪TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性进行检测,同时利用Real-time PCR方法分析TNF-α基因C-791T位点不同基因型在大白猪11个组织中的mRNA差异表达情况.结果表明,大白猪TNF-α基因启动子区-791 bp处存在碱基突变(C> T),并检测到3种基因型,分别为:CC、CT和TT.TNF-α基因在断奶仔猪脾脏、肺脏、胸腺和淋巴结等免疫器官中表达量均较高;TT和CT基因型个体在11个组织中TNF-α基因表达量普遍高于CC基因型个体,且在十二指肠及空肠组织中达到差异显著性水平(P <0.05).因此,TNF-α基因启动子区C-791T突变对该基因的mRNA表达水平产生显著影响,有必要将TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性作为提升机体肠道病原菌抗性的遗传标记进行深入研究.     

不同日龄苏太仔猪LTβR基因组织表达谱及发育性表达规律分析

试验旨在探讨LTβR基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,为进一步研究该基因与F18大肠杆菌致病的相关性提供理论依据。本试验选取从初生到断奶的4个日龄(8、18、30和35日龄)苏太仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法分别比较分析了LTβR基因在各个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠及空肠)间的表达规律。结果表明,LTβR基因在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、淋巴结、十二指肠及空肠组织中呈现较高水平的表达,并且表现出明显的发育性表达差异。LTβR基因在8日龄仔猪淋巴、十二指肠和空肠组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在8日龄仔猪肺脏组织中的表达极显著高于35日龄(P<0.01),且显著高于30日龄(P<0.05);在35日龄仔猪肝脏组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在35日龄仔猪胃组织中的表达显著高于18日龄(P<0.05)。由此推测,8日龄左右为仔猪肠道免疫屏障快速形成期,LTβR基因的较高表达可能有利于仔猪对F18大肠杆菌抗性。     

基于主成分分析构建大白猪一般抗病力的评估模型

为构建大白猪一般抗病力的评估模型,本研究分别检测了30日龄大白猪血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、TNF-α和IFN-γ 8个重要细胞因子的浓度,并对这8个指标进行了主成分分析.结果显示,选取前5个特征值作为5个主成分(累计贡献率达到87.721%),基本上反映了原先免疫指标的全部信息;通过建立主成分综合评价模型,比较30日龄腹泻及健康大白猪断奶仔猪的主成分综合得分,健康组断奶仔猪综合得分为0.080,而腹泻组断奶仔猪综合得分为-0.009.本研究初步确定了影响大白猪一般抗病力的主成分,并且对其进行了初步验证,为今后大白猪一般抗病力的早期选育提供了一定的指导和依据.     

猪杀菌/通透性增加蛋白基因siRNA载体构建及干扰效果评价

本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)BPI基因的高效siRNA干扰载体,为在细胞水平上研究猪BPI基因的功能和作用机制提供基础。参照猪BPI基因(GenBank登录号:EF436278)全长编码区序列,设计其特异性发夹siRNA干扰片段,并将其克隆插入pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR干扰载体中,构建猪BPI基因4个干扰siRNA表达载体RB1、RB2、RB3和RB4,1个阴性对照NC,并通过PCR和测序进行验证,构建成功后转染猪小肠上皮细胞IPEC-J2并检测其干扰效率。结果发现,所构建的4个特异性siRNA载体均可显著降低猪BPI基因mRNA表达(P0.05),其中RB4载体干扰效果最好,其干扰效率达到69%。本研究成功筛选可靶向干扰猪BPI基因的高效siRNA,为今后在细胞水平进一步研究BPI基因对猪肠道革兰阴性菌感染抗性的作用及其机制奠定了试验基础。     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。