罗斯河病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank中收录的罗斯河病毒(RRV)基因序列,以其保守的E2基因为靶序列,设计并筛选出一套特异性LAMP引物;通过优化反应条件,最终建立了RRV RT-LAMP检测方法,并对其灵敏度、特异性进行了验证。结果显示:本方法对RNA样本的最低检测限可达10拷贝/25μL,而荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的灵敏度分别为10拷贝/25μL、100拷贝/25μL;其特异性良好,不与同属或相似病毒发生交叉反应。结果表明,本方法灵敏、特异、快速、便捷,可应用于我国虫媒病高发区的RRV筛查预警。     

炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL~(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

真鲷虹彩病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种检测真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增(LAMP)方法,满足口岸、养殖场对该病的快速监测的需求,本研究比对分析了Gen Bank中公布的真鲷虹彩病毒基因组序列,筛选其主要衣壳蛋白MCP基因保守区序列,进行LAMP引物设计,建立了真鲷虹彩病毒LAMP检测方法。对扩增条件进行优化,确定最佳反应条件为62℃,45 min。灵敏度试验结果显示,该方法最低检测限为100拷贝/μL目的基因。特异性试验结果显示,该方法不与流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙病毒3型(FV3)、甲鱼虹彩病毒(STIV)发生交叉反应。结果表明,本研究建立的LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。对5份疑似真鲷虹彩病毒感染的临床样品进行检测,发现检测结果与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法检测结果符合率为100%。研究表明,本方法具有灵敏度高、特异性强,以及仪器设备简单、操作便捷、结果直观等优点,非常适合作为初筛手段,应用于养殖场、口岸等一线的疫病监测。     

高通量测序分析5例进口鱼粉鱼源性成分构成

为揭示鱼粉原料构成,保证鱼粉质量,本研究应用高通量测序技术对来源于不同国家的5例进口鱼粉样品进行测序,并基于COI基因及其丰度对鱼粉鱼源性成分构成进行分析。提取鱼粉样品DNA后应用鱼类通用COI基因扩增引物进行PCR扩增,得到鱼类混合COI基因序列产物,将扩增产物送测序公司进行高通量测序,将COI基因测序数据与鱼类相关数据库进行比对,通过比对结果进行鱼粉的物种源性成分分析。结果显示,成功获得了5例鱼粉样品中原料鱼成分,其中白鱼粉原料鱼主要成分为鳕鱼;而红鱼粉原料鱼成分较为多样,涉及鲱鱼、竹刀鱼等。通过Python对数据进行统计分析,绘制PCR扩增后鱼类COI基因丰度图,进一步直观提示鱼粉样品中原料的成分构成。本研究结果表明,高通量测序技术可应用于鱼粉质量评估,有助于快速了解鱼粉构成,对其质量及用途进行指导,同时,提示该技术可进一步应用于鱼粉掺杂掺假及致病微生物的监测工作中,对保障鱼粉产品质量、维护正常市场秩序具有重要意义。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20 min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。     

反刍动物埃立克体荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速、准确地检测反刍动物埃立克体,本研究以反刍动物埃立克体pCS20为靶基因设计特异性引物和探针,建立了TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与OIE推荐的套式PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,本方法特异性强,与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体无交叉反应;TaqMan和Eva Green荧光定量PCR对pCS20质粒标准品的最低检测限分别为17.4拷贝·μL^-1和1.74拷贝·μL^-1,标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对420只钝眼蜱样本的检测显示,TaqMan和Eva Green荧光定量PCR的检出率分别为25.48%和29.29%,与套式PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为反刍动物埃立克体的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

南非蜱虫套式PCR鉴定方法的建立

为探讨来自南非不同蜱种的系统进化关系,建立南非截获蜱虫的套式PCR鉴定方法。根据GenBank中蜱虫的18SrRNA基因序列,设计2对特异性引物,通过优化条件建立蜱虫套式PCR鉴定方法。从南非进口生牛皮上截获寄生蜱,经过形态学初步鉴定后,应用所建立的套式PCR扩增获得10种南非蜱虫(T1-T10)的18S rRNA基因序列,测序后与NCBI中已公布的蜱虫18S rRNA基因序列进行同源性分析。应用MEGA5.0软件进行系统进化分析发现,T1、T2、T3、T4、T7、T8是花蜱属的亚种,T5和T6分别是牛蜱属的不同种或亚种;T9和T10是扇头蜱属的不同种或亚种。说明建立的套式PCR检测方法能够在传统形态学分类的基础上,准确鉴定不同形态的蜱种。     

高通量测序分析5例进口鱼粉鱼源性成分构成

为揭示鱼粉原料构成,保证鱼粉质量,本研究应用高通量测序技术对来源于不同国家的5例进口鱼粉样品进行测序,并基于COI基因及其丰度对鱼粉鱼源性成分构成进行分析。提取鱼粉样品DNA后应用鱼类通用COI基因扩增引物进行PCR扩增,得到鱼类混合COI基因序列产物,将扩增产物送测序公司进行高通量测序,将COI基因测序数据与鱼类相关数据库进行比对,通过比对结果进行鱼粉的物种源性成分分析。结果显示,成功获得了5例鱼粉样品中原料鱼成分,其中白鱼粉原料鱼主要成分为鳕鱼;而红鱼粉原料鱼成分较为多样,涉及鲱鱼、竹刀鱼等。通过Python对数据进行统计分析,绘制PCR扩增后鱼类COI基因丰度图,进一步直观提示鱼粉样品中原料的成分构成。本研究结果表明,高通量测序技术可应用于鱼粉质量评估,有助于快速了解鱼粉构成,对其质量及用途进行指导,同时,提示该技术可进一步应用于鱼粉掺杂掺假及致病微生物的监测工作中,对保障鱼粉产品质量、维护正常市场秩序具有重要意义。     

施马伦贝格病焦磷酸测序检测方法的建立

为适应口岸施马伦贝格病快速、准确、高通量检测需求,建立一种基于RT-PCR及焦磷酸测序技术平台的施马伦贝格病检测方法。本研究针对施马伦贝格病毒基因组RNA的S、M和L三个基因节段保守区域利用焦磷酸测序软件PyroMark Q96ID分别设计RT-PCR扩增引物及焦磷酸测序引物,以人工合成的SBV重组质粒为模板分别建立了SBV S、M、L基因的PCR-焦磷酸测序检测方法,比较三基因的PCR扩增结果以及测序分析结果,结合特异性检测结果,最终确定以M基因作为靶基因建立的焦磷酸测序检测方法效果最好,并以德国FLI提供的SBV（BH80株）RNA对所建立的方法进行验证,通过对测得序列的比对分析可确定为施马伦贝格病毒,这表明本研究所建立的方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可以用于施马伦贝格病毒基因序列水平上的精准检测鉴定。     

猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示：猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。