猪肺脏气道上皮干细胞的特异抗体筛选与抗原表达研究

猪肺脏气道上皮主要由基底细胞,克拉拉细胞,纤毛细胞,杯状细胞等上皮细胞类型组成,筛选猪气道上皮干细胞的相关特异性抗体,观察其特异抗原的表达,将有助于对猪气道上皮干细胞的分离、鉴定和生物学特性的研究.试验中,制备远端气道上皮细胞的冰冻切片与细胞爬片,利用免疫荧光染色法,分析不同物种来源的抗体对猪气道上皮细胞的免疫染色反应;同时利用Oct3/4、Sox2、CD133和SSEA-1等10种上皮干细胞相关抗体分析猪气道上皮干细胞表面抗原表达情况.通过试验,筛选出在猪气道上皮干细胞相关抗体,并发现气道组织冰冻切片未检测到这10种抗体相关的阳性细胞,而在细胞爬片中观察到CD49f和CD117阳性细胞数量较多.免疫荧光共染发现这些CD49f和CD117阳性细胞同时也表达基底细胞表面标记Keratin 14.这可能是正常情况下猪气道上皮干细胞数量极为稀少,表面抗原表达量低而不易检测到,在肺脏气道上皮受到外环境刺激时(如消化),上皮干细胞开始增殖以完成损伤修复作用发生数量上的增殖.综上所述,利用Keratin 14和CD49f或CD117(c-kit)双标染色法可以鉴定猪肺脏气道上皮干细胞的候选亚群来用于其生物学特性与功能的研究.     

表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究

为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价.结果表明,免疫后小鼠特异性IgG、SIgA及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70％.结果表明rAd.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护.本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础.     

产肠毒素大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的构建及表达

为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC) STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用Pac Ⅰ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&-PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定.结果显示,重组腺病毒Ad5 STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.