高寒草甸牧草内生解淀粉芽孢杆菌261MY6生防潜力评价

本研究以番茄丁香假单胞叶斑病菌Pseudomonas syringa为指示菌,采用含菌平板抑菌圈测定法,从高寒草甸牧草内生细菌中筛选获取优良拮抗菌株261MY6,结合形态学、生理生化、16S rDNA及gyrB基因序列分析将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通过平板对峙法、溶磷法、Salkowski法及盆栽试验等测定其生物功能及室内盆栽防效。结果表明,菌株261MY6对番茄丁香假单胞叶斑病菌的抑菌圈直径达1.20 cm,盆栽防效达68.71%。具有溶解无机磷、固氮和分泌IAA的功能,对马铃薯褐腐病菌（Stysanus stemonitis）、马铃薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）、马铃薯枯萎病菌（Fusarium avenaceum）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、黄瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯褐腐病菌（Stysanus stemonitis）、孜然根腐病菌（F. Solani）和番瓜根腐病菌（Fusarium sp.）有良好抑制作用。该结果为解淀粉芽孢杆菌261MY6进一步开发利用提供了理论依据。     

一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis ZA1)培养条件的优化

为了提高生防菌株莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis ZA1)液体发酵的生物量,利用单因素试验设计与响应曲面试验设计相结合的方法对ZA1摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,ZA1的最佳培养基配比为氯化铵14.25 g、玉米粉19 g、马铃薯237 g、水1000 mL,最佳发酵条件为pH 7.7、培养温度28℃、转速180 r/min及发酵时间36 h,ZA1优化后活菌数为4.12×10¹⁰ CFU/mL。通过中心组合试验设计确定ZA1在10 L发酵罐中的最佳溶氧量为60%和转速为180 r/min;最优条件下,发酵ZA1的放罐时间确定为36 h,活菌数达到1.59×10¹¹ CFU/mL。该结果为利用ZA1开发生防制剂奠定了基础。     

内生枯草芽孢杆菌265ZY4对温度和紫外光胁迫下紫花针茅生化特征的影响

在高、低温和紫外线胁迫下,将高寒草地紫花针茅的内生细菌265ZY4回接至紫花针茅测定其对寄主抗胁迫能力的影响。结果表明,接种265ZY4后紫花针茅的株高增加35.02%,叶宽增加34.69%;在低温、高温和紫外线胁迫下带菌紫花针茅叶绿素含量高于对照,温度胁迫下叶绿素呈先上升后下降,但紫外线胁迫下呈快速下降;在低温和紫外线胁迫下带菌紫花针茅可溶性糖含量分别在第4和6天后显著高于对照,但可溶性蛋白含量低于对照,温度和紫外线胁迫下可溶性蛋白和可溶性糖呈“上升-下降”的趋势;低温胁迫下带菌紫花针茅超氧化物歧化酶(SOD)活性变化显著小于对照,带菌及对照均呈“降低-升高-降低”的规律;紫外线胁迫下带菌植株SOD活性呈现“下降-上升”的趋势,第8天时显著高于对照,对照表现为“下降-上升-下降”的趋势;在低温和紫外线胁迫下带菌紫花针茅苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性高于对照,且在低温胁迫下呈“上升-下降”的趋势,但在高温和紫外线胁迫下呈“下降-上升-下降”的趋势。试验结果表明,内生细菌265ZY4有助于维持逆境胁迫下宿主生化指标的稳定,提高宿主对逆境的忍耐能力。     

一株抗马铃薯坏疽病生防细菌B-401产抑菌物质条件优化及稳定性

以马铃薯坏疽病菌为靶标菌株,采用含药平板法对高寒草地禾草内生细菌B-401产抑菌物质条件及抑菌物质的稳定性进行了研究。结果表明,生防菌株B-401产抑菌物质的最佳培养基配方为牛肉膏8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g、水1000mL,最适温度为23.4℃,最适pH值为7,最佳装液量为35.2mL/150mL三角瓶,最佳培养方式为光照条件下振荡培养24h,最适发酵时间为96h,优化验证试验结果表明,其对马铃薯坏疽病菌的EC₅₀＝0.111μL/mL,是优化前EC₅₀＝3.196μL/mL的3.47%。菌株B-401所产抑菌物质在25~90℃具有较好稳定性,抑菌活性均大于75%,在100℃及以上高温处理后抑菌物质活性降低;对酸碱性和紫外照射稳定,相对活性分别在77.45%和98%以上;对金属离子Na⁺、Mg²⁺和Mn²⁺稳定,相对活性达99%以上,而对Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺较不稳定。     

生防菌株ZA1的GFP基因标记及其功能稳定性测定

为明确生防莫海威芽胞杆菌Bacillus mojavensis菌株ZA1在作物体内定殖与作物和病原物的作用机理,运用电击转化法将绿色荧光蛋白表达载体pGFP78导入菌株ZA1体内,并采用细菌培养法、继代培养法和平板抑制法检测其功能稳定性。结果表明,质粒pGFP78成功导入菌株ZA1,标记后菌株ZA1-gfp经形态学和分子生物学验证均证明菌株ZA1已成功标记,标记菌株ZA1-gfp与菌株ZA1形态一致,在荧光显微镜下呈现明亮的绿色,并且能够提取导入质粒pGFP78,扩展出质粒所携带的启动子78序列。功能稳定性鉴定结果表明,标记菌株ZA1-gfp遗传稳定性达100%;与菌株ZA1的生长速率差异不显著,且不影响菌株的运动性;菌株ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑制率分别为64.50%、68.35%和66.55%,标记菌株ZA1-gfp对3种病原真菌的抑制率分别为67.46%、76.56%和66.75%,表明外源质粒的导入,不影响菌株的抑菌能力。     

番茄细菌性叶斑病菌的拮抗菌筛选、鉴定及其拮抗性能评价

采用含菌平板抑菌圈测定法,从120株高寒草地牧草内生细菌中分离筛选到一株对番茄细菌性叶斑病拮抗能力较强的菌株264ZY7,其抑菌圈直径为1.22 cm。264ZY7菌体短杆状,大小为1.534 μm×0.571 μm~3.210 μm×0.781 μm,革兰氏阳性菌,根据形态特征,并结合16S rDNA和gyrB基因序列相似性分析,将菌株264ZY7鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。通过室内盆栽防效试验,结果表明该菌株对番茄细菌性叶斑病的防效达69%,此外,该菌株对8种病原真菌具有抑菌能力,说明抑菌谱较宽,且抑菌率均大于30%,对番瓜根腐病菌(Fusarium sp.)效果最明显,抑菌率为52.84%。该研究结果为高寒草地紫花针茅内生细菌264ZY47的进一步开发利用提供了依据。     

珠芽蓼内生细菌ZA1的抑菌物质产生条件的优化及其稳定性测定

从珠芽蓼中分离的内生细菌ZA1对马铃薯坏疽病菌具有良好的抑菌效果,鉴定为莫海威芽孢杆菌。本文通过平板对峙法对ZA1分泌物抑制马铃薯坏疽病菌的培养条件进行了优化,并对ZA1抑菌粗提物的稳定性进行了测定。结果表明,ZA1的最佳培养基为B培养液,最佳发酵温度为17.8℃,培养基的最佳pH是6.9,150 mL三角瓶的最佳装液量为20 mL,最佳培养方式为暗处理振动培养96 h,经对ZA1进行优化培养,其对马铃薯坏疽病菌的EC₅₀=0.1228 μL/mL,是优化前EC₅₀=4.5888 μL/mL的37倍。ZA1的抑菌粗提物90℃下处理2 h,其相对活性达到76.62%,具有耐高温的特性;对紫外线照射30 min后相对活性差异不明显; pH为3和11时,其相对活性分别为92.87%和85.11%;对蛋白酶和Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺等金属离子不敏感,经Ag⁺处理后的相对活性可达到86.93%。     

珠芽蓼内生菌ZA1对马铃薯的防病促生研究

利用常规方法对莫海威芽孢杆菌ZA1分泌吲哚乙酸(IAA)、固氮、溶磷和产抑菌酶等能力进行定性测定,并在室内和大田条件下对其防治马铃薯病害及促生作用进行了研究。ZA1在含和不含色氨酸的King培养基中分泌IAA分别为12.17和9.75 mg/L,具有固氮能力并能分泌胞外蛋白酶,但无溶磷能力,且不能产生几丁质酶和葡聚糖酶;10倍液喷雾对贮藏期马铃薯坏疽病的防效达85.9%;20倍液拌种对田间马铃薯晚疫病防效为26.56%,但马铃薯商品薯增产率达36.29%,每hm²增产率达33.88%。采用10倍稀释液对马铃薯块茎拌种后盆栽55 d,根、茎及叶绿素含量均高于对照,其中经10倍ZA1处理后,根长与干、鲜重分别增加8 cm、0.75 g和5.07 g,株高、茎粗及茎干、鲜重分别增加2.74 cm、0.27 cm、0.52 g和5.73 g,干湿根冠比分别增加0.214和0.094,叶绿素含量增加0.54 mg/g;且可诱导马铃薯植株内的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT )和苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性增加。本研究明确了菌株ZA1对马铃薯的防病促生作用及对其防御酶的诱导,为ZA1开发成为微生物农药及菌肥提供理论依据。     

高寒草甸牧草内生解淀粉芽胞杆菌261MY6发酵工艺优化

为提高生防菌株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）261MY6的生物量,本试验对高寒草地内生细菌解淀粉芽胞杆菌261MY6生长温度、pH和生长周期等进行测定,并结合单因素试验和正交设计试验对其发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明,菌株261MY6最高生长温度为56℃、最低温度为4℃、致死温度为95℃和最适温度为28~36℃,最适pH值为5~7,在5 h进入对数生长期,在10 h时进入稳定生长期。最优发酵培养基为：牛肉膏3 g,乳糖25 g,MgSO₄ 3 g,酵母膏7 g,水1000 mL。最优发酵条件为：温度32℃,接种量14%,装液量40 mL·（150 mL）^-1,摇床转速210 rpm,pH 7。最优条件下,发酵261MY6,最佳放罐时间为30 h,活菌数达2.37×10¹² CFU·mL^-1。该结果为菌株261MY6开发为微生物菌剂奠定了基础。