猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。     

H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感抗体的间接ELISA方法。该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好,通过检测40份血清,与HI检测结果相比较,其符合率达86.5%。该方法为检测H3亚型猪流感抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。     

猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。