黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种组培快繁技术研究

本研究以黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种蒴果为外植体,通过对种子无菌萌发和原球茎诱导、原球茎增殖及丛生芽诱导、生根壮苗以及移栽驯化研究,建立杂交石斛兰的组培快繁技术体系。结果表明,最适合种子无菌萌发和原球茎诱导的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖20 g/L+马铃薯50 g/L;原球茎增殖及丛生芽诱导的最佳培养基为1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂6.8 g/L+碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L,继代培养50 d,增殖系数达6.19;最佳生根壮苗培养基为1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号0.5 g/L+蔗糖25 g/L+琼脂6.8 g/L+碳粉1.0 g/L+马铃薯50 g/L+香蕉50 g/L,培养2个月后,平均株高达7.14 cm,平均根数6.17条,平均根长6.46 cm,生根率达100%。体积比为单一松树皮和松树皮∶兰石=1∶1适于移栽,移栽65 d成活率分别达到96.32%和96.71%。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

墨兰PI基因过表达载体构建及功能初步分析

MADS-box基因是植物中一类重要的转录调控因子,在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用,并参与花器官的发育和开花时间的调节。兰花中存在大量MADS基因,但这些基因的作用仅有少量研究报道。本研究将墨兰MADS基因家族中PI (PISTILLATA)基因cDNA开放框序列连接到pBWA(V)HU-ccdB-GUS载体上,构建了过表达载体,随后通过农杆菌介导法转化铁皮石斛原球茎,获得转基因株系;采用潮霉素抗性筛选,获得阳性植株,并利用试管开花技术,获得阳性植株开花苗,对开花表型进行观察。结果显示,PI基因在铁皮石斛中过表达能导致铁皮石斛花朵表型发生变化,阳性转化苗花朵在整体花型、中萼瓣和捧瓣的形状、花瓣边缘颜色、合蕊柱内侧的斑点区和紫色条带、舌瓣的颜色和形状等方面都发生了变异,尤其在舌瓣变化最明显,说明PI基因可能与兰花花瓣表型形成有关。本研究结果可为阐明墨兰舌瓣的形成机理及兰花基因工程育种性状改良提供参考依据。