转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果0.910,扩展标准不确定度（K=2）为0.013。     

甘蓝型油菜中KCS6基因的克隆和功能分析

采用基因组步移和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,从甘蓝型油菜中双9号中克隆到了KCS6基因。甘蓝型油菜中KCS6基因有两个拷贝:BnKCS6c(与甘蓝的mRNA 99%同源)和BnKCS6a(与白菜的mRNA 99%同源)。这两个拷贝的编码区长度均为1 494bp,含有2个外显子,一个长1 045bp,另一个449bp。种子发育初期KCS6基因在角果皮和种子中表达量高,随着种子成熟表达量迅速降低。两个KCS6的转基因都可以在酵母中正常表达,但不能合成超长链脂肪酸,表明酵母中异源表达的KCS6蛋白没有活性,或KCS6蛋白不能以酵母的脂肪酸作为催化底物合成超长链脂肪酸。     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

花生种子发育过程中脂肪酸累积模式研究

花生种子脂肪酸组成是决定花生油营养和储藏品质的关键因子。本文通过对花生种子脂肪酸累积模式的研究,揭示花生脂肪酸组成的形成规律。在开花结荚期和荚果成熟期每隔7天取材一次,果针入土后第7天第一次取材,对各个时期果仁进行脂肪酸分析,研究脂肪酸组成及积累规律;并对种子发育全过程的脂肪酸组成进行相关分析和主成份分析。研究结果显示,下针后10天内的花生种子可检测到9种脂肪酸,C16:1和C18:3在发育过程中由高到低,逐渐消失,其他7种脂肪酸则随着花生种子的发育逐渐积累增高。成熟的花生种子中油酸和亚油酸含量占脂肪酸总含量的81%左右。脂肪酸总量在接近成熟时有所下降。不同脂肪酸在累积过程中显示了高度相关性,C16:1和C18:3之间呈正相关,属于第一类;其余7种脂肪酸之间也均呈正相关,属于第二类。第一和第二类脂肪酸之间呈负相关。主成份分析表明,9种脂肪酸可以分成三类：C18:1与C18:2各为一类,其他7种脂肪酸为另一类,C18:1与C18:2之比是花生脂肪酸组成的决定性因素。通过分析表明,决定花生脂肪酸组成的关键基因主要是脂肪酸去饱和酶FAD2基因和SAD基因,有目的地对这两个基因的表达进行调控对于花生脂肪酸组成的改良有着重要的价值和意义。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

新型花生内源特异参照基因的开发与应用研究

一个物种的内源特异参照基因是该物种区别其它物种的特异性标志之一。本研究通过对GeneBank中花生基因信息的检索分析,筛选出花生几丁质酶基因chi2.2作为该物种内源特异参照基因的候选基因。通过对该基因的特定区域设计引物,建立了花生产品特异性定性PCR检测方法。利用该方法分别对16个花生品种的DNA进行PCR扩增,均能扩增出81bp的片段。利用相同引物分别对其他油料作物、粮食作物和蔬菜等（油菜,大豆,芝麻,向日葵,油棕,棉花,水稻,玉米,长豆角,豌豆,土豆,萝卜,辣椒,茄子,拟南芥,烟草）的DNA进行PCR扩增,均未发现特异性扩增产物。 结果表明,本研究建立的花生产品检测方法具有很好的物种特异性,且其灵敏度达到0.05ng基因组DNA。该方法可用于花生源成分鉴定,如确定食品中是否含有花生源成分,本研究为识别掺假使杂和保障食品安全提供有效手段。     

转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究

通过分析全球商业化种植的转基因作物分子特征,选取常用的调控元件启动子CaMV35S、FMV35S和nos,终止子NOS、T-35S、g73′和E93′,标记基因bar、NPTII、hptII、pmi作为筛查靶标序列,通过重组PCR技术将这些元件克隆到双元载体pBI121上,构建成包含11个转基因元件的通用阳性质粒分子pBI121-ELEMENTS。质粒序列信息已提交至GenBank并获得序列号HM047294。该质粒分子对目前国内外批准的5类主要转基因作物(大豆、油菜、玉米、棉花和水稻)理论筛查覆盖率达到91.5%,对我国批准进口的27种转基因作物的理论筛查覆盖率达100%。以pBI121-ELEMENTS为阳性对照,筛查7个转基因品系,结果显示该分子能够有效用于转基因作物定性筛查。     

转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果为0.910,扩展标准不确定度(K=2)为0.013。     

油料作物内标准基因研究与应用

内标准基因（Endogenous Reference Gene）是指具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。可用于对基因组中某一目的基因进行定量分析和验证PCR反应体系中是否存在抑制物质。基于其物种特异性,内标准基因还能用于食品搀假使杂的判定。油料作物涉及我们日常生活的方方面面,油料制品的鉴别和转基因油料作物的检测急需使用内标准基因。目前,油料作物内标准基因的研究与应用取得了长足进展,但是还没有对它们进行综合比较和分析的报道。本文根据国内外有关油料作物内标准基因的研究,阐述了各物种已开发的内标准基因。并对这些基因从引物位置、扩增片段的大小、拷贝数等特征进行比较和分析。本文综述了油料作物内源特异参照基因的研究概貌和存在问题,有助于对油料作物及其他作物内源特异参照基因的进一步开发和深入研究。     

转基因油菜筛查检测策略研究

根据收集到的国内外已商业化转基因油菜品种的基因元件信息,构建了油菜转基因检测分子特征矩阵,在分析基因元件使用频率的基础上,建立了转基因油菜的筛查检测策略。研究发现,利用P-CaMV35S、P-FMV35S和bar这三个元件组合,对现有转基因油菜品种的筛查检出率可达100%。将P-CaMV35S、P-FMV35S、bar、CP4-¬EPSPS、PAT和T-NOS组合,每个转化事件可检出至少两次,增加了检测的可靠性。同时,分析了不同转化事件中同名基因元件的序列差异,进一步验证了分子特征矩阵筛查方法的可行性。