紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

不同土地利用方式对土壤磷有效性和溶磷细菌群落结构的影响

为探究不同土地利用方式对土壤磷有效性和溶磷细菌群落的影响,以海南省白沙县龙眼园（LO）和由龙眼园转化的有机茶园（OTP）、传统无机茶园（CTP）土壤为研究对象,利用Illumina高通量测序技术分析土壤phoD功能微生物的群落结构,研究土壤速效磷与phoD功能微生物和酸性磷酸酶的相关性。结果表明：龙眼园转换成无机茶园后,在0~10 cm土层,pH、总氮（TN）、总磷（TP）、速效钾（AK）和有机碳（SOC）含量显著降低。同时,在10~20 cm土层,pH、总氮（TN）、总磷（TP）和有机碳（SOC）含量也显著降低。在0~10 cm土层,土壤速效磷（AP）含量在龙眼转化成有机茶园和无机茶园后分别降低了16%和71%。在10~20 cm土层,有机茶园土壤速效磷（AP）提高了56%,而无机茶园的速效磷（AP）含量降低了65%。相似性分析表明,土地利用方式明显改变了土壤phoD微生物群落结构。但是,土层深度并没有改变phoD微生物群落结构。RDA分析表明,土壤pH、总钾（TK）、速效钾（AK）和硝态氮（NO₃^--N）是驱动phoD功能微生物群落结构分异的主要环境因子。土壤速效磷（AP）含量与phoD功能微生物密切相关,其中Betaproteobacteria在调控土壤磷的有效性中发挥重要作用。研究结果表明,龙眼园转化成茶园改变了phoD微生物群落结构,同时降低了有机茶园土壤总磷（TP）和无机茶园土壤有效磷（AP）含量。与无机茶园相比,有机管理可以提高土壤速效磷（AP）含量。     

荔枝剪枝堆肥和蚯蚓粪作为巨大普里斯特氏菌载体的研究

为探讨荔枝茎秆堆肥与蚯蚓粪替代草炭作为巨大普里斯特氏菌载体的可行性,以荔枝剪枝堆肥、蚯蚓粪和草炭为原料构建6种微生物载体（ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6,三者质量比分别为6∶2∶2、4∶2∶4、2∶2∶6、6∶3∶1、4∶3∶3、2∶3∶5）,以草炭为对照,巨大普里斯特氏菌为目标微生物,动态监测载体中有效活菌数,获得适宜巨大普里斯特氏菌存活的载体;在此基础上,分别设置含水量20%、30%、40%,温度20、30、40、50℃和接种浓度10⁶、10⁷、10⁸cfu·mL^-1,动态监测载体中有效活菌数,优化载体含水量、温度和接种浓度。结果表明：随着培养时间的延长,各载体中活菌数均呈先降低后升高的趋势,其中ST2、ST5载体长期培养后活菌数高,且草炭添加量低,是适宜的巨大普里斯特氏菌载体。随着载体含水量、温度的升高,培养的60 d过程中ST2和ST5载体活菌数均呈先升高后降低的趋势,在30%含水量（ST2 2.46×10⁸ cfu·g^-1、ST5 1.81×10⁸ cfu·g^-1）以及30℃（ST2 3.44×10⁸ cfu·g^-1、ST5 1.87×10⁸ cfu·g^-1）、40℃（ST2 8.50×10⁷cfu·g^-1、ST5 7.13×10⁷cfu·g^-1）温度下的活菌数最高。此外,各培养时期的载体活菌数均随着接种浓度的升高而升高,培养60 d后,ST2、ST5载体活菌数分别达3.63×10⁸、3.33×10⁸cfu·g^-1。研究表明,载体ST2和ST5适宜代替草炭作为巨大普里斯特氏菌的载体,且在30%载体含水量、30~40℃温度和10⁸ cfu·mL^-1接种浓度下效果最佳。