鸡SPOP和MyD88基因分子特征及其组织表达特性分析

【目的】掌握SPOP和MyD88基因分子特征及其在鸡不同组织发育过程中的表达特征,为后续研究其调控鸡组织生长发育机理及开展抗病育种提供参考依据。【方法】通过RT-PCR克隆鸡SPOP和MyD88基因编码区（CDS）序列,运用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL及PSORT II Prediction等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测这2个基因在鸡胚14胚龄（E14 d）及出壳后1 d（H1 d）、7 d（H7 d）和14 d（H14 d）各组织中的表达情况。【结果】鸡SPOP、MyD88基因CDS序列长为1125和900 bp,分别编码374和299个氨基酸残基。SPOP蛋白分子式为C₁₈₆₆H₂₉₂₆N₄₉₆O₅₅₉S₂₈,相对分子量为42 kD,理论等电点（pI）为5.58,为相对不稳定蛋白;MyD88蛋白分子式为C₁₅₀₂H₂₃₉₄N₄₁₀O₄₃₈S₁₈,相对分子量为33 kD,pI为5.93,为相对不稳定蛋白。鸡SPOP和MyD88蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要定位于细胞质（占60.9%）。与人类和哺乳动物相比,鸡SPOP蛋白的3个功能结构域（MATH、BTB-POZ和BACK）较保守,而MyD88蛋白的2个功能结构域（Death和TIR）存在多处氨基酸位点变异。SPOP和MyD88基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,但以肺脏中的相对表达量最高,且二者间的表达差异极显著（P<0.01,下同）。从E14 d发育至H14 d,SPOP基因在眼球和肺脏中的表达整体上呈上升趋势,且至H14 d时肺脏中的表达趋于稳定,在脑组织、心脏和肌胃中的表达呈先上升后下降的变化趋势,在肝脏中的表达呈先下降后上升再下降的变化趋势;MyD88基因在眼球、肝脏和肺脏中的表达均呈先上升后下降再上升的变化趋势,在肌胃和胸肌中的表达呈下降趋势,至H14 d时降至最低值。【结论】SPOP和MyD88基因在鸡胚不同发育阶段肺脏、眼球和肌胃中的表达相对较高,SPOP基因的表达水平均极显著高于MyD88基因,且二者的相对表达量呈负相关,即SPOP基因负调控MyD88基因的表达。     

鸡BRD2基因及其剪接体的克隆测序与亚细胞定位分析

[目的]克隆鸡含溴结构域蛋白2(BRD2)基因及其剪接体,并对其进行序列分析和亚细胞定位,为深入研究鸡BRD2基因及其剪接体在细胞转录调控中的作用机理打下基础.[方法]通过RT-PCR扩增鸡BRD2基因及其剪接体的编码区(CDS)序列,采用BioEdit、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、CDART等在线软件进行生物信息学分析;鸡BRD2基因及其剪接体经Xho I和BamH I双酶切后,分别亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1多克隆位点上构建重组真核表达载体,通过转染HEK-293T细胞进行亚细胞定位分析.[结果]鸡BRD2基因CDS序列全长2340 bp,编码779个氨基酸残基,分子量为85.66 kD,理论等电点(pI)为8.74,其编码蛋白二级结构主要由无规则卷曲(60.59%)和α-螺旋(28.50%)组成,含有3个明显的功能结构域(2个BD结构域和1个ET结构域).与鸡BRD2基因相比,其剪接体BRD2-X1、BRD2-X2和BRD2-X3的CDS序列长分别为2301、2283和1983 bp,编码766、760和660个氨基酸残基.以鸡BRD2氨基酸序列为参照,BRD2-X1表现为第526~537位氨基酸缺失,BRD2-X2表现为第1~19位氨基酸缺失,BRD2-X3表现为第1~119位氨基酸缺失;与鸡BRD2蛋白相比,鸡BRD2基因剪接体BRD2-X1和BRD2-X2并未影响鸡BRD2蛋白的功能结构域,而剪接体BRD2-X3导致鸡BRD2蛋白第一个BD结构域部分缺失.鸡BRD2基因融合蛋白EGFP-BRD2及其剪接体融合蛋白EGFP-BRD2-X1、EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3均定位在细胞核,EGFP-BRD2和EGFP-BRD2-X1在细胞核中呈均匀分布,而EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3在细胞核中呈不均匀的点状分布.[结论]鸡BRD2蛋白及其剪接体均定位在细胞核,但BD结构域缺失可引起BRD2剪接体BRD2-X3细胞核定位模式的变化.     

鼠抗鸡膜联蛋白A2多克隆抗体的制备及应用

为制备鼠抗鸡膜联蛋白A2(ANXA2)多克隆抗体,检测ANXA2蛋白在鸡不同组织中的表达情况,先构建鸡ANXA2基因的重组原核表达载体pET-32a-ANXA2,将其转化入大肠埃希菌中进行诱导表达;采用切胶纯化和切胶免疫小鼠的方法制备鸡ANXA2多克隆抗体,然后利用该抗体检测ANXA2蛋白在4周龄SPF鸡不同组织中的表达情况.结果表明:鸡ANXA2重组蛋白His-ANXA2在IPTG终浓度为0.1 mmol·L-1、诱导时间为5 h的条件下表达量高.通过切胶纯化和切胶免疫方法获得了具有较高效价和特异性的鸡ANXA2蛋白鼠多克隆抗体.组织表达检测结果显示,ANXA2蛋白在鸡法氏囊、胸腺、十二指肠、肾脏、脑、腿肌和心脏中有表达,而在肝脏、脾脏、肺脏、腺胃和胰腺中未检测到表达.这一研究获得的鼠抗鸡ANXA2蛋白多克隆抗体为后续研究鸡相关病毒的复制和致病机制奠定了基础.     

鸡TATA结合蛋白的亚细胞定位及基因组织表达特性分析

为探究鸡TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)的亚细胞定位以及TBP基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达情况,首先扩增鸡TBP基因的蛋白质编码区(CDS),将其亚克隆至真核表达载体pCMV-Myc构建重组真核表达载体pCMV-Myc-TBP,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),然后利用...     

鸡卵泡膜细胞中膜联蛋白A2互作细胞蛋白的筛选及其功能分析

【目的】从鸡卵泡膜细胞蛋白中筛选和鉴定与膜联蛋白A2（ANXA2）相互作用的细胞蛋白并进行功能分析,为深入研究ANXA2调控鸡卵泡发育的作用机制提供理论依据。【方法】制备开产后30周龄贵州黄鸡的卵泡膜细胞,提取卵泡膜总蛋白后利用His Pull-Down联合质谱技术（LC-MS/MS）从卵泡膜细胞中筛选出与鸡ANXA2互作的细胞蛋白,然后通过GO数据库和KEEG数据库分别进行GO功能富集分析及KEEG信号通路注释分析,并利用STRING Version 11.0绘制蛋白互作网络图。【结果】通过His Pull-Down联合LC-MS/MS共鉴定获得41个鸡ANXA2互作细胞蛋白,GO功能富集分析发现这些互作细胞蛋白在分子功能、生物学进程和细胞组成均发挥作用。其中,在分子功能方面主要涉及蛋白结合（占58.06%）、催化活性（占19.35%）、核糖体结构（占16.13%）及细胞骨架结构组成（占6.45%）,在生物学进程方面主要参与细胞骨架（占19.35%）、刺激反应（占19.35%）、翻译（占16.13%）、代谢过程（占12.90%）、细胞迁移（占12.90%）、蛋白折叠（占9.68%）和蛋白运输（占9.68%）,而细胞组分显示以定位于细胞膜的蛋白为主（占32.26%）。鸡ANXA2蛋白互作细胞蛋白参与的KEEG信号通路主要有应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫系统和蛋白定位等。鸡ANXA2互作细胞蛋白互作网络可分为3条,即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作细胞蛋白间存在复杂的互作关系,其中又以膜联蛋白A1（ANXA1）与烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2的互作关系最明显。【结论】鸡ANXA2互作细胞蛋白主要参与细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,涉及应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫及蛋白定位等信号通路。其中,PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通过与ANXA2蛋白相互作用而参与鸡卵巢相关疾病的发生,而ANXA1与ANXA2相互作用可能在鸡卵泡的发育及排卵过程中发挥重要调节作用。     

鸡BRD2亚细胞定位及其组织表达特性分析

[目的]明确含溴结构域蛋白2(BRD2)的亚细胞定位及其表达特征,为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据.[方法]通过构建鸡BRD2基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后检测重组蛋白EGFP-BRD2的表达情况及亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR分别检测鸡胚14胚龄(E14 d)、鸡出壳后1日龄(1 d)、7日龄(7 d)和14日龄(14 d)4个时间点各组织中BRD2基因的表达情况.[结果]重组真核表达载体pEGFP-C1-BRD2转染HEK-293T细胞获得的融合蛋白EGFP-BRD2约115.00 kD,且主要定位在细胞核.实时荧光定量PCR检测结果表明,鸡BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相对表达量最高,在7和14 d肺脏中的相对表达量最高.BRD2基因在各组织的表达规律为:在眼球内E14 d到14 d的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏内的表达在E14 d至14 d间呈先下降后上升的变化趋势;在肝脏内E14 d表达稳定,1 d后开始逐渐增加,至14 d时达最高值;在肺脏中E14 d的表达下降,1 d后急剧上升,至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中,均在7 d时最高,1 d时最低,E14 d和14 d时有较高表达,整体上呈倒N表达模式;在腿肌中,从E14 d到1 d表达减少,而后略有增加,7 d后开始下降,至14 d时降到最低值.[结论]鸡BRD2基因重组真核表达载体能在HEK-293T细胞中正确表达,且融合蛋白主要定位在细胞核;BRD2基因在鸡不同发育阶段的各组织中均有表达,但其表达量呈现不同的变化趋势.     

鸡TRAF6和TIFA基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】分析肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）及具有叉头相关结构域的TRAF相互作用蛋白（TIFA）基因在贵州黄鸡不同发育阶段各组织中的表达特点，为后续开展TRAF6和TIFA基因调控鸡的生长发育及二者相互作用调控鸡相关病毒复制打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增鸡TRAF6和TIFA基因编码区（CDS）序列，通过ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL及MegAlign等在线软件进行生物信息学分析；同时采用实时荧光定量PCR分别检测TRAF6和TIFA基因在鸡胚发育第14 d （E14d）、鸡出壳第1 d （H1d）、第7 d （H7d）和第14 d （H14d）不同组织中的表达情况。【结果】鸡TRAF6和TIFA基因CDS序列全长分别为1638和564 bp，编码545和187个氨基酸残基，对应的编码蛋白分子量约62和22 kD，理论等电点（pI）为6.14和5.18。鸡TRAF6蛋白二级结构中无规则卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸链占11.86%、β-转角占2.92%，鸡TIFA蛋白二级结构中无规则卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸链占16.58%、β-转角占3.74%，二者均以无规则卷曲和α-螺旋为主。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比对分析均显示鸡与火鸡的相似性最高，分别为96.4%和92.2%，符合物种进化规律，也表明TRAF6和TIFA基因在禽类中具有一定的遗传保守性。TRAF6和TIFA基因在贵州黄鸡不同发育阶段的眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表达，且内脏组织的相对表达量普遍高于肌肉组织，以肺脏中的相对表达量最高，其次是肝脏和肌胃；从E14d发育到H14d，鸡TRAF6和TIFA基因在肺脏、肝脏和肌胃中的表达均呈先下降后上升的变化趋势，在眼球中则呈先上升后下降再上升的变化趋势，在脑组织、胸肌和腿肌的表达水平较低且趋于稳定。【结论】 TRAF6和TIFA基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达，且以肺脏和肝脏中的表达水平相对较高，在脑组织、胸肌和腿肌中的表达相对较低，故推测TRAF6和TIFA基因相互作用对鸡的生长发育具有调控作用。