牛前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前体脂肪细胞分化的早期开始表达,PPAR-γ在分化的中期开始高度表达,而脂联素在牛前体脂肪细胞分化的前期未检测到,在细胞分化后期高度表达。【结论】用Ⅰ型胶原酶消化法可获得大量的牛前体脂肪细胞。培养的牛前体脂肪细胞成分均一、生长旺盛,经胰岛素诱导后能稳定的向脂肪细胞分化。     

Krüppel-Like Factor 3（KLF3）基因对牛脂肪沉积的作用

【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3 基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA（NC）,并进行诱导分化培养至第0天和第4 天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α, C/EBPα）,脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α, ACCα）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第 4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2 具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天 和第4 天与对照组相比分别下调了58% 和37%,达到了差异极显著（P<0.01）,C/EBPα 的表达量也分别下调了64% 和41%,达到了差异极显著（P<0.01）。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4 天分别下调了89% 和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50% 和37%, 而FAS的表达量则分别下调了73% 和19%,都分别达到了差异极显著（P<0.01）。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降（P<0.05）。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。     

表皮生长因子（EGF）对牛前脂肪细胞增殖和分化的影响

以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化.     

新农村建设视角下的乡村旅游发展措施研究

乡村旅游是乡村和城市连接的桥梁,在"三农"问题、城乡统筹和社会主义新农村建设中起了至关重要的促进作用,在新农村建设背景下,乡村旅游的发展被提升到新的高度。本文基于新农村建设视角,对乡村旅游发展中的各项问题展开分析,并探讨相关问题的对策。     

基于慢旅游理念下乡村旅游开发研究

随着社会经济的快速发展,人民生活水平不断提高,人们的生活节奏不断加快。与此同时各行各业之间的竞争也在不断加剧。越来越多的人们厌倦了每日的两点一线之间的生活方式,而传统的休闲旅游又无法满足人们对于不同生活方式体验的需求。在这种情况下,慢旅游的理念逐渐得到人们的青睐与认可。慢旅游的理念就是通过打造休闲、度假、娱乐为一体的全新生活方式,为广大游客提供个性化的高品质旅游体验,满足当代人民群众对于慢生活方式的追求,更提升人们对于生活的美好感受。本文针对慢旅游理念下乡村旅游的规划与开发进行全面分析,促进慢旅游产业的发展。