Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因重组表达质粒的构建。利用来自重组质粒pLmleA的，mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件。以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS—PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中。获得的转化子在添加了L-苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L-苹果酸及L-乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L-苹果酸转化成L-乳酸，L-苹果酸和L-乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，L-乳酸的生成量为1002—1106mg／L。苹果酸的相对降低率为19．16—22．34％。     

Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸－乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因重组表达质粒的构建，利用来自重组质粒pLmleA的mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白，斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到     

葡萄酒活性干酵母的温度适应性研究

研究了20余种工业化葡萄酒活性干酵母对高温与低温的适应性。结果表明,供试菌株在37℃均生长良好,其中10#-1,10#-2,11#-1,11#-2和21#等5个菌种在供试菌中较耐高温,在45℃仍可生长;在10～16℃培养时,随着温度的降低,菌体生长的速度减慢,其中9#,15#,18#,26#,27#和30#对低温(10℃)的适应性略强;同一菌种个体间在生长速度和生长量上存在差异。     

用苹果酸通透酶基因的特异性引物进行酒酒球菌快速鉴定

以Oenococcus oeni苹果酸通透酶基因为目标基因,设计了1对特异性引物PmlepL/PmlepR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过PmlepL/PmlepR引物的PCR扩增,可得到苹果酸通透酶基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其他种类乳酸菌未扩增出目标带。引物PmlepL/PmlepR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。     

Oenococcus oenj苹果酸-乳酸发酵关键酶基因在酿酒酵母中的转化与表达

利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP)约2.6kb的基因片段,并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒pYELmleAP,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YS58,筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测,采用t检验差异显著性分析,结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4d,培养液中的L-苹果酸含量降低,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低,苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成,供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368mg/L,与对照差异显著。     

Oenococcus oeni MLF关键基因在酿酒酵母中的转化与表达

利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcus oeni )优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP )约2.6 kb的基因片段，并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleAP，转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中，SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测，采用t检验差异显著性分析，结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4 d，培养液中的L-苹果酸含量降低，培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低，苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成，供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368 mg/L，与对照差异显著。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.