贝莱斯芽孢杆菌LJ02中植物免疫蛋白的筛选及其功能

【目的】贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）分离,收集不同峰值处的蛋白组分。以烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分。液相质谱联用仪（LC-MS）检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白（flagellin,Flg^LJ02）。将鞭毛蛋白Flg^LJ02进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应（hypersensitive reaction,HR）和抗病试验验证其免疫功能。为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测水杨酸（salicylic acid,SA）和乙烯（ethylene,ET）途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白Flg^LJ02免疫信号转导途径。【结果】HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分（F-1—F-60）,免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7%。经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白Flg^LJ02等7种物质。选择鞭毛蛋白Flg^LJ02为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白。将粗提蛋白过柱、透析纯化后的Flg^LJ02渗入珊西烟（Nicotiana tabacum var. xanthi）叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应。将Flg^LJ02稀释为终浓度50、100、200 μg·mL ^-1的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6%、76.1%、88.1%。用鞭毛蛋白Flg^LJ02处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调。【结论】贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白Flg^LJ02可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性。