毛果杨腺苷酸合成酶基因ACS-1的克隆和酶学分析

乙酰辅酶A连接酶(ACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,与4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)有着紧密的进化关系。通过对毛果杨数据库中4CL基因的同源检索,克隆获得了毛果杨基因Prt4CL8的序列(命名ACS-1,Genebank登录号XM_002329288.1)。序列分析表明,ACS-1具有ACS的关键残基以及C端末尾的PTS1序列;而4CL的高度保守结构域box Ⅰ和box Ⅱ在该蛋白中不保守。利用PCR技术克隆序列,构建表达载体pET30a,转化大肠杆菌并表达重组蛋白。对其进行酶学活性分析,结果证明该蛋白不能催化4CL常见底物,而对ACS底物乙酸钠具有明显催化活性:K_m为(0.25±0.02)mmol·L^-1;V_m为(8.63±0.63)mmol·L^-1。结果表明,ACS-1是ACS家族成员,为腺苷酸合成酶超基因家族成员的鉴定与功能分析提供了一定的理论基础。