CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

利用CRISPR_Cas9技术创建拟南芥Argonaute2基因缺失突变体

Argonaute2(AGO2)在植物抗病和发育过程中发挥重要作用。为创制拟南芥ago2核苷酸插入/缺失突变体材料,分析了拟南芥AGO2基因结构,选择其外显子上3个靶点构建了CRISPR_Cas9基因编辑载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥,利用潮霉素对T₀代种子进行筛选,获得62株T₁代抗性苗;然后提取T₁代抗性苗DNA,进行潮霉素特异引物PCR扩增检测,确定获得53棵转基因阳性苗。随机选择10株T₁代阳性苗,扩增包含靶点的基因片段进行测序,结果显示,在第1个靶点附近6株苗产生了编辑,第2靶点附近10株苗全部成功编辑,第3个靶点未发生编辑。编辑位点附近产生了多种编辑形式,以PAM前删除或者增加1个碱基的形式出现频率最高,也有删除大于10碱基的编辑形式,最长可删除106个碱基。这些突变株系的获得为深入研究拟南芥AGO2的功能提供了丰富的遗传材料。     

镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

[目的]筛选出镉（Cd）胁迫下构树中稳定表达的内参基因，为后续开展构树耐Cd的分子机理研究奠定基础。[方法]以Cd胁迫下构树的根和叶组织为材料，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10个候选基因（BpUBE2、 BpRPL8、 Bp Actin、 BpGAPDH、 BpHSP、 BpTUA、 BpDOUB、 Bpβ-TUB、 BpHIS、BpNADH）的表达情况，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估，并通过逆境胁迫响应基因BpDREB验证筛选出的内参基因的稳定性。[结果]BpDOUB和BpNADH在Cd胁迫下构树中基因表达相对稳定，BpGAPDH表达稳定性最差。以BpDREB验证内参稳定性时发现，单独或组合使用BpDOUB及BpNADH为内参基因时，BpDREB基因表达水平显示出相似的趋势，而稳定性较差的BpGAPDH基因未能对BpDREB的表达量进行准确校正。[结论]BpDOUB、BpNADH基因以及Bp DOUB+BpNADH基因组合均可作为合适的内参基因，提高Cd胁迫下构树相关基因表...