枣黑斑病菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建

以枣黑斑病菌和含有双元载体根癌农杆菌为材料,对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌液浓度、菌株共培养时间、共培养温度等条件进行优化,筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。以农杆菌介导枣黑斑病菌最佳的遗传转化体系为基础,进行GFP标记实验室保存枣黑斑病菌的菌落,继代培养后,通过观察菌落生长形态,生长速度以及致病力测定筛选获得遗传相对稳定、与野生枣黑斑病菌相比性状没有发生明显变化的荧光蛋白标记菌株。挑取单菌落于10 ml的LB液体培养基(含100μg·ml~(-1)卡那霉素)中,28℃震荡(180 r/min)培养48 h,吸取400μl培养液于20 ml含有200μmol·L-1的AS(乙酰丁香酮,acetosyringone)、100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM液体培养基中,28℃震荡(180 r/min)培养5~6 h共培养。将Alternaria alternata菌株所产的孢子洗下,制成浓度为1.0×106个/ml的悬浮液。分别取上述农杆菌液与孢子悬浮液各100μl均匀混合,涂布于含有200μmol·L-1AS和100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM平板上的硝酸纤维化膜(NC膜)表面,在25℃下黑暗共培养60 h,然后将NC膜转到含有潮霉素B的PDA平板上4~7天,获得约200个转化子,获得GFP标记的菌株。