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利用LoxP-Cre同源重组原理,以表达盒堆积的方式组合光呼吸代谢支路改造基因AtGDH、EcGCL和EcTSR,成功构建了多基因转化载体pYL-GCL-GDH-TSR,通过根癌农杆菌侵染以及潮霉素筛选,获得了马铃薯转化植株。分子检测表明,转基因植株中3个目的基因在mRNA水平均能得到表达,但在蛋白水平无表达。转基因植株在表型和微型薯的发育上与野生型植株无明显区别,可能原因是由于多基因一次性转化与叶绿体定位的双重要求,增加了马铃薯遗传转化及蛋白有效表达的难度。 相似文献
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为了将大肠杆菌的乙醇酸代谢途径引入马铃薯叶绿体构建光呼吸代谢支路,同时规避目标蛋白不能通过叶绿体信号肽定位的风险,研究采用了Cre-Lox P多基因组装、融合蛋白表达、多顺反子表达等技术构建多基因质体转化载体,一次性将目标基因引入叶绿体基因组。研究成功构建了多基因质体转化载体,将编码壮观霉素抗性筛选标记氨基葡糖苷腺苷转移酶aad A、绿色荧光蛋白GFP、大肠杆菌乙醇酸脱氢酶(EcGLC)的3个亚基,乙醛酸聚醛酶(EcGCL)和羟基丙二酸半醛还原酶(Ec TSR)的7个基因添加到受体载体,最终的载体大小为18.1 kb。在构建的过程中,研究发现供体受体质粒的大小比例、Prrn启动子在细菌中的启动基因的表达等问题严重影响重组的效率。以上研究结果为光呼吸的代谢改造研究提供了一个新的思路,并解除了质体转化载体构建中基因数量的限制,对于叶绿体中复杂的代谢途径构建具有借鉴意义。 相似文献
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