玉米APX基因家族的表达分析及ZmAPX2基因的鉴定与表达载体构建

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是细胞抗氧化防御中的重要酶之一,植物受到各种环境胁迫时,在调节活性氧水平方面发挥着重要作用.试验采用荧光定量PCR方法,分析玉米APX基因家族在不同干旱胁迫下的表达模式,并从玉米自交系B73中成功克隆得到ZmAPX2基因,利用生物信息学软件构建了 ZmAPX2基因的系统进化树,并预测了 ZmAPX2蛋白的结构与功能,构建p3301-ZmAPX2-Bar表达载体.结果表明:玉米APX2基因在不同干旱胁迫下均呈上调表达,在PEG6000干旱胁迫24 h时,叶片中的表达量最高,为对照的4.3倍,说明其在抗旱方面能够起到重要的作用.以NCBI GenBank中玉米APX2基因ORF序列为模板设计引物并进行扩增,克隆得到的CDS序列在NCBI进行同源性比对,与ZmAPX2同源性为100％.ZmAPX2基因全长cDNA序列大小为1 021 bp,ORF序列为753 bp,编码250个氨基酸;玉米ZmAPX2基因与高粱同源性最高,与菠菜同源性最低;ZmAPX2基因编码的蛋白没有信号肽,无跨膜结构,为可溶性蛋白;亚细胞定位于细胞质上;ZmAPX2蛋白的第120位氨基酸亲水性最强,属于亲水性蛋白;ZmAPX2蛋白质结构由a-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成.     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。