CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低,对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难,位点特异性核酸酶的出现和应用,大大提升了同源重组的效率,使基因组编辑变得更加高效和精确,从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶（ZFN）和TALE核酸酶（TALENs）是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统,但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足,如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等,另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前,该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前,CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限,但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理,进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用,主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望,希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。     

刺山柑果实中还原糖及总糖含量的分析

[目的]分析刺山柑果实中还原糖及总糖的含量。[方法]采用3.5-二硝基水杨酸法对刺山柑果实中还原糖及总糖的含量进行测定。[结果]应用水提法(100℃)提取的刺山柑果实中还原糖的含量在11.6%左右,提取温度对提取结果有明显影响;刺山柑果实中的总糖含量在24.5%左右。[结论]刺山柑果实中还原糖和总糖含量相对较高,具有较好的开发前景。     

地被菊CVB病毒基因的RT-PCR检测

为建立可靠、灵敏且高效的地被菊中菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)的检测方法,利用特异性CVB基因引物,通过RT-PCR技术进行了特异性、重复性和灵敏度测试,最终利用优化的RT-PCR体系对地被菊植株感染CVB病毒情况进行了检测。结果显示,以染病地被菊植株的总RNA为模板扩增出的特异性片段编码211个氨基酸,与基因数据库中其它来源的CVB基因外壳蛋白同源性为96%~99%,可确定为菊花B病毒外壳蛋白基因;重复性和灵敏度检测中均获得了清晰的目标条带,且1 ng的总RNA即可扩增出特异性片段;对7个地被菊品种共32个植株的检测中,CVB的检出率为56.2%,检测的准确率为68.75%。表明建立的地被菊CVB基因的RT-PCR检测体系可有效用于地被菊植株感染病毒情况的鉴定。     

荔枝果皮中类黄酮提取工艺研究

研究潮州产荔枝果皮中类黄酮的乙醇提取工艺。以乙醇为溶剂,以荔枝果皮为原料,以荔枝果皮中类黄酮质量分数为考察指标,通过单因素和正交试验,考察乙醇质量分数、提取温度、固液比及提取时间对类黄酮质量分数的影响。最终确定乙醇质量分数60%、提取温度50℃、固液比1：20、提取时间2h为荔枝果皮中类黄酮的最佳提取工艺条件。在此工艺条件下,荔枝果皮类黄酮1次提取质量分数约为7.68%。     

乙醇等有机溶剂对肿瘤细胞PC12的毒性剂量分析

分析一定浓度的甲醇、乙醇、丙酮和甘油作用下肿瘤细胞 PC12形态和生存率的变化,确定上述有机溶剂对细胞的毒性剂量。研究发现,PC12细胞对上述溶剂表现出不同的耐受性,其中乙醇的毒性剂量最低,20 ml/L浓度作用24 h细胞生存率就下降近40%;该浓度的丙酮和甲醇干预 PC12细胞24 h对应的细胞生存率则分别下降约20%和15%;甘油的作用相对缓和,但随着干预浓度逐渐增大时,也表现明显的细胞毒性。该研究可为后续药理研究提供参考资料。