籽粒苋优质贮藏蛋白AhAMA1基因功能分析

解析籽粒苋编码优质贮藏蛋白基因AhAMA1的功能,以期为应用于作物品质改良提供依据。从籽粒苋(cv. SX-04)发育种子中分离AhAMA1基因,检测其时空表达谱。应用生物信息学工具分析AhAMA1蛋白理化特性,构建AhAMA1基因组成型植物表达载体,并通过农杆菌介导渗透侵染法在本氏烟草叶组织瞬时表达AhAMA1,并检测烟叶组织的总蛋白质、油脂和淀粉及必需氨基酸含量。结果发现,AhAMA1基因在籽粒苋种子发育后期表达量最高;分离到的AhAMA1编码序列与数据库中AMA1基因ORF序列(915 bp)完全一致,编码304个氨基酸;AhAMA1分子量为34.96 ku,理论等电点(pI)为6.65;成熟蛋白含有29个带正电的氨基酸(Arg+Lys)和30个带负电的氨基酸(Asp+Glu);总平均亲水性为-0.343,属于疏水蛋白;AhAMA1蛋白不稳定指数为32.78,属于稳定蛋白。系统进化树分析结果显示,AhAMA1与千穗谷凝集素序列同源性达99%,亲缘关系较近。AhAMA1基因瞬时表达导致烟草叶片蛋白含量提高到22.39%,是野生型烟草叶片蛋白含量的2倍,油脂和淀粉含量比野生烟草稍有下降。研究成功分离到AhAMA1基因编码序列,其异源表达可提高宿主组织蛋白质和必需氨基酸含量。研究结果可为应用该基因提高植物蛋白含量及品质改良提供科学参考。     

杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

[目的]w-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸(18∶1)去饱和形成亚油酸(18∶2),是多不饱和脂肪酸合成过程中的第一个关键酶。为了探究DsFAD2在盐藻油脂合成积累中的作用。[方法]本文以运城盐湖分离的富油杜氏盐藻(Dunaliella salina)株系(YC-011)为材料,利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因,并对DsFAD2编码蛋白进行了跨膜区、高级结构及氨基酸序列比对等一系列生物信息学分析。应用qRT-PCR检测DsFAD2基因在氮(N)胁迫培养条件下的表达模式。[结果]DsFAD2蛋白定位于内质网中,有5个跨膜区,具有典型膜结合蛋白的结构特征。此外,DsFAD2也具有所有FAD2蛋白家族所特有的3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列。系统发育分析发现杜氏盐藻DsFAD2与莱茵衣藻CrFAD2、团藻VcFAD2亲缘关系最近。qRT-PCR表明,与正常培养的杜氏盐藻相比,缺N培养显著诱导DsFAD2上调表达,N胁迫8d时DsFAD2的表达量是未胁迫对照的2.8倍。[结论]DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应,促进多不饱和脂肪酸形成,增强藻细胞抗逆性。本研究为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考。     

蛋白核小球藻超声波破壁方法的优化

[目的]蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生长快、光合作用强、富含蛋白质和油脂等化合物,可广泛应用于食品、医药和生物能源等行业。建立简易、安全和高效的藻细胞破壁技术是蛋白核小球藻等微藻高值天然化合物萃取及其商业化生产的关键环节之一。[方法]本文以蛋白核小球藻为试材,以细胞破碎率和油脂得率为指标,对超声波破壁法的条件(藻液体积、藻细胞含水量等)和参数(功率、时间、温度等)进行系统优化。[结果]结果表明,超声波破壁最佳条件和参数为:室温25℃,湿藻液pH5,藻细胞含水量20%～50%,超声波输出功率250 W,处理时间为15min,和处理量每次120mL。依此条件和参数进行处理,蛋白核小球藻破壁率达94.8%,油脂萃取率达40.1%。[结论]这一优化的超声波破壁方法简便高效、成本低,对后续产品加工无负影响,为建立蛋白核小球藻高值天然产物的规模化生产工艺提供了科学依据。     

猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及瞬时表达

猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7 FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检测来自猫爪草的酰基-ACP-Δ9脱氢酶(MucACP-Δ9D)是否可异源表达用于在其他植物合成ω-7 FA,文章构建了MucACP-Δ9D基因植物表达载体,并通过农杆菌介导在本氏烟草叶组织瞬时表达。用气相色谱(GC)检测烟叶脂肪酸成分,结果显示,野生型及空载体对照的ω-7FA总含量仅为0.4%;然而,MucACP-Δ9D瞬时表达的烟叶组织ω-7 FA总含量提高到14.2%,其中,C16∶1Δ9和C18∶1Δ11含量分别达8.8%和5.4%。研究表明,MucACP-Δ9D可在异源组织催化棕榈油酸合成,可进一步用于其他油料作物的油脂遗传改良,以富集ω-7 FA。     

紫苏脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息学及其表达特性分析

为研究脂肪酸硫酯酶A(FatA)在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的作用,对紫苏FatA基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明,PfFatA基因cDNA全长1 652 bp,开放阅读框1 119 bp,编码372个氨基酸;紫苏FatA基因编码的蛋白质为亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域;含Acyl-ACP_TE保守结构域,属于Hotdog fold超蛋白家族;多序列比对结果发现,序列C端含有保守的三联肽AKL和SKV结构;系统进化树分析表明,紫苏与丹参亲缘关系较近。通过Real-time PCR分析得知,PfFatA在紫苏根、茎、叶、花和种子不同发育时期均有表达,其中,在种子发育初期表达量最高。该研究结果可为进一步阐明PfFatA基因的功能及作用机制奠定基础。     

紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析

[目的]本试验将已克隆的紫苏种子中高表达二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因PfDGAT1转化至酿酒酵母突变型菌株H1246进行酵母互补功能验证,研究二酰甘油酰基转移酶是否具有催化油脂合成的作用。[方法]通过构建紫苏DGAT基因的酵母表达载体pYES2.0-PfDGAT1并转化至酿酒酵母突变型菌株H1246,用尼罗红对转基因酵母细胞染色,检测转基因酵母中是否能合成油体;利用薄层层析(TLC)试验检测转基因酵母中是否存在三酰甘油(TAG)。[结果]转pYES2.0-PfDGAT1载体的突变型酵母菌株H1246能够检测到有油体存在,而转pYES2.0空载体的突变型酵母菌株H1246中没有检测到油体,说明紫苏PfDGAT1基因的表达恢复了酿酒酵母突变型菌株H1246油体缺陷的表型,可以催化TAG合成。[结论]PfDGAT1基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,该研究结果为深入解析PfDGAT1基因在紫苏油脂合成途径中的功能奠定了基础。     

紫苏二酰甘油酰基转移酶基因(PfDGAT1)鉴定及表达分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是TAG合成过程中的限速酶。以晋紫苏1号为材料,采用电子克隆技术获得DGAT1基因(PfDGAT1,AF298815.1),并对PfDGAT1基因序列进行生物信息学及表达特性分析。结果表明,PfDGAT1基因序列全长为1 964 bp,开放阅读框长度为1 605 bp,共编码534个氨基酸残基;多序列比对和系统进化树分析表明,紫苏Pf DGAT1蛋白与芝麻、油橄榄的DGAT1蛋白的亲缘关系较近,序列同源性分别为89%和83%;利用实时荧光定量PCR技术分析PfDGAT1基因在紫苏不同组织中的表达特性,结果显示,PfDGAT1基因在紫苏不同组织中均有表达,但在种子中表达量最高,且随种子发育表达量呈先升高后降低的变化趋势,在开花后20 d表达量达到最高。     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

一株优异螺旋藻的分离及其优化培养

[目的]规模化养殖螺旋藻(Spirulina sp.)联产营养均衡食品、功能保健品和药品已日益发展为一种工农融合的新型产业。培育高产高效优质藻种始终是螺旋藻产业发展的主攻领域。[方法]从规模化螺旋藻养藻池水体分离纯化到一株优异的螺旋藻变异株Sp-SX07。生物量和藻蓝蛋白含量等测定显示,该藻株生物量大、生长速度快、藻蓝蛋白含量丰富。通过对不同光质、光照强度、pH值、温度等培养条件下该藻株生产特性的测试,建立了该藻株优化培养的主要参数。[结果]在LED暖白光(光暗比12h/12h)、光照强度4 000lx、温度25～30℃、起始pH 8.5～9.5之间生长良好,连续培养12d平均日生长量为0.87g·L~(-1),比出发株Sp-SX02高45%。藻蓝蛋白含量达藻粉干重23.69%,比出发株高42%左右。[结论]优异螺旋藻藻株Sp-SX07的鉴定及优化培养参数的建立为该优异藻株商业化生产及富含藻蓝蛋白的功能食品研发提供了科学依据。     

杜氏盐藻LYCB基因克隆及在盐胁迫下的表达分析

[目的]为探究杜氏盐藻(Dunaliella Salina)富集β-胡萝卜素的分子机理。[方法]本文选用从运城盐湖分离的杜氏盐藻株系Ds-YC011为试材,克隆编码番茄红素-β-环化酶(lycopene b-cyclase,LYCB)的基因(DsLYCB)并分析其功能。[结果]DsLYCB基因cDNA全长1 910bp,开放阅读框(ORF)长1 769bp,编码584个氨基酸。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构,定位于叶绿体。蛋白二级结构中α-螺旋结构占39.9%,杜氏盐藻DsLYCB蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,在高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因表达量显著上升,胁迫4h时表达量达峰值,为正常对照(1.5mol·L~(-1))条件下的2倍。高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因上调表达模式与藻细胞类β-胡萝卜素积累增加相一致,预示着DsLYCB在杜氏盐藻类β-胡萝卜素合成积累中起重要作用。[结论]这为解析微藻类胡萝卜素合成调控机制及遗传修饰提供了科学依据。