炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。     

LIPI-4 EⅡC调控单增李斯特菌关键毒力因子转录的研究

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC(EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P<0.01),黏附能力无显著变化(P>0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2～4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05),但在8～12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、...     

LIPI-4 EII对单核细胞增生性李斯特菌关键毒力因子转录调控的影响

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶(EII)对LM毒力基因表达的调控作用，本研究分别构建EII缺失株(LM928ΔEII)、强启动子回补株(CLM928ΔEII-P_help)和天然启动子回补株(CLM928ΔEII-P_native)，测定各菌株在体外培养中的生长曲线和在永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)内的增殖情况；RT-qPCR检测体外培养和HCMEC/D3细胞内各菌株9个关键毒力基因的转录水平。结果显示:1)EII基因缺失株LM928ΔEII构建成功，重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-P_native及回补株CLM928ΔEII-P_help和CLM928ΔEII-P_native构建成功。2)在体外培养下，EII对LM的生长曲线没有影响。但在侵染HCMEC/D3后，LM928ΔEII在8和12 h的胞内细菌量显著高于LM928(P<0.05)，2和4 h的胞内细菌量极显著高于LM928(P<0.01)，CLM928ΔEII-P_native在2、4和6 h恢复至野生株水平(P>0.05)，而CLM928ΔEII-P_help在2、4、6、8、10和12 h均极显著低于野生株(P<0.01)。3)体外培养条件下，相比于野生株，LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01)；CLM928ΔEII-P_help中66.7%(6/9)的基因转录水平上升1~4倍，CLM928ΔEII-P_native中88.9%(8/9)的基因转录水平倍数变化在1倍以内。在HCMEC/D3细胞内，相比于野生株，LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01)；CLM928ΔEII-P_help中33.3%(3/9)的基因转录水平上调1~3倍，CLM928ΔEII-P_native中基因转录水平倍数变化在1倍以内。综上，LIPI-4 EII对LM关键毒力因子的转录具有负调控作用。本研究为系统探究LIPI-4参与LM致病性机制奠定基础。