苹果LIM基因家族生物信息学及表达分析

【目的】在苹果全基因组中鉴定LIM,通过分析启动子作用元件、保守结构域、基因聚类、基因结构、染色体定位以及组织表达模式,为研究和利用苹果LIM奠定基础。【方法】利用苹果基因组数据库GDR和PLAZA,获得苹果LIM家族成员并进行编号。苹果LIM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测,利用Cell-PLoc进行亚细胞定位预测,利用CD-Search Tool进行LIM结构域分析,采用MEGA 7软件构建进化树,采用GSDS绘制基因结构,并利用TBtools软件对鉴定得到的MdLIM进行染色体定位,通过实时荧光定量RT-PCR对MdLIM的组织表达进行分析,并利用SPSS 18.0软件分析差异显著性。【结果】共鉴定得到11个苹果LIM家族成员,这些MdLIM蛋白包含96—222个不等的氨基酸残基,等电点分布在6.14—9.01。亚细胞定位结果显示,MdLIM蛋白在细胞核中均有分布。启动子作用元件分析表明,11个MdLIM启动子上分布有响应激素、环境适应性和逆境诱导的元件。蛋白保守结构域分析表明,11个MdLIM蛋白中除MdLIM8具有单LIM结构域外,其余10个均具有双LIM结构域。根据聚类分析结果可将MdLIM分为4组。染色体定位结果显示,MdLIM分布在苹果17条染色体中的7条,且MdLIM在7条染色体上的分布不均匀。花、叶、果皮和茎中的实时荧光定量RT-PCR结果显示,4个组织中均能检测到MdLIM的表达,且表达量具有一定差异。【结论】苹果LIM基因家族包括11个成员,进化上可分为4组,11个基因分布于7条染色体上,在不同组织中的表达具有多样性和特异性。     

苹果果实大小相关的ARF-Aux/IAA互作组合筛选

【目的】通过转录组学和生物信息学,在苹果全基因组中对可能互作的MdARF和MdIAA进行鉴定,为明确相关基因功能和解析生长素调控苹果果实大小的分子机理奠定基础。【方法】对野生大果型‘皇家嘎啦’和miRNA172p过表达的转基因小果型‘皇家嘎啦’进行不同发育时期和不同组织材料的转录组测序,对测序结果进行基因的功能注释及差异表达分析。利用转基因小果和野生型大果的转录组数据,筛选在果实发育中表达的苹果MdARFs和MdIAAs基因家族成员,通过逐一在两个家族间计算基因时空表达的相关系数,筛选可能互作的MdARF-MdIAA组合,将从拟南芥基因组中下载的23个ARFs和34个Aux/IAAs、番茄基因组中下载的21个ARFs和25个Aux/IAAs,分别与互作候选MdARFs和MdIAAs进行比对,并进一步构建系统发育树。使用MEME和TBtools对苹果候选互作对中的MdARFs和MdIAAs蛋白进行Motif分析。利用STRING蛋白互作预测数据库进行同源映射,构建苹果中的蛋白-蛋白互作网络,进一步的确认候选互作对,最终得到苹果中通过互作参与果实发育可能性最高的MdARF-MdIAA组合。【结果】分别对野生型‘皇家嘎啦’和miR172OX转基因‘皇家嘎啦’盛花期后两周的全果和盛花期后4周的果皮、果肉和果核进行转录组测序,共生成178.19 Gb的数据量,各项指标均表明,3个生物学重复在所有组织类型上均具有高度一致性。在转录组数据中,共鉴定到38个MdARFs和27个MdIAAs在至少一个文库中的FPKM值大于2,在苹果果实发育时期表达。通过计算Pearson相关系数对表达的MdARFs和MdIAAs两两进行相关性分析,其中8对MdARF-MdIAA的相关系数大于0.9或小于-0.9,作为初步筛选的候选互作组合。将8对组合中的MdARFs和MdIAAs分别与拟南芥和番茄中的ARFs和IAAs进行序列比对并构建系统进化树后发现,MdARF6和MdARF19与起转录激活作用的AtARFs同属一个分支。而MdARF2、MdARF4和MdARF9则与起转录抑制作用的AtARFs具有较近的亲缘关系。Motif分析结果显示,候选MdARF、MdIAA蛋白中均包含Motif 2和Motif 5。Motif 2和Motif 5分别对应IAA蛋白中的保守结构域Motif IV和Motif III。互作蛋白在拟南芥中进行同源映射校验后,最终得到两对MdARF-MdIAA组合可用于进一步的功能验证。【结论】苹果MdARF和MdIAA家族成员,在果实发育时期,有8对组合在表达量上存在显著的相关性,进一步同源映射确认互作后,最终确定MdARF4-MdIAA17和MdARF4-MdIAA19两对互作组合,极有可能通过互作传递生长素信号参与调控苹果果实发育。     

苹果U6启动子的克隆及功能分析

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。     

苹果叶片不定芽再生过程的差异表达基因鉴定与分析

【目的】筛选分析‘GL-3’苹果叶片不定芽再生过程中的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,进一步解析苹果叶片不定芽再生的潜在分子机制,为提高苹果的遗传转化效率提供理论参考。【方法】‘GL-3’苹果继代组培苗叶片外植体接种在再生培养基上,分别于0、3、7、14和21 d后取样并提取RNA,构建mRNA文库后采用Illumina Nova seq平台进行测序。筛选出各时间点的DEGs,根据GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释结果以及官方分类,使用R软件中的phyper函数对筛选到的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用BLAST软件进行基因比对注释;重点分析植物再生相关的激素、酶、转录因子、多胺等DEGs;采用qRT-PCR对DEGs进行定量验证。【结果】再生培养基上培养3、7、14和21 d的苹果叶片外植体与对照组相比,分别筛选到5 250、4 937、6 852、6 493个DEGs,4个时间点共有的DEGs有3 027个。DEGs的GO功能富集显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要与氧化还原过程、细胞外围、蛋白激酶活性和有机环化合物结合等功能有关;下调表达的DEGs主要与单细胞代谢过程、钙离子结合、光合膜和类囊体部分等功能有关。DEGs的KEGG通路富集分析显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要富集在磷酸戊糖途径、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用和内质网蛋白质加工等途径中;下调表达的DEGs主要富集在α-亚麻酸代谢、苯丙烷生物合成、碳代谢和光合作用等途径中。对与植物离体叶片再生相关的激素、酶、转录因子和多胺等相关DEGs的表达模式进行分析发现,这些DEGs大部分呈上调表达趋势。经qRT-PCR验证后,所检测基因的表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】通过对苹果叶片不定芽再生过程中不同时间点的基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量与苹果叶片不定芽再生相关的基因,研究结果为深入探讨苹果离体叶片再生机理提供了理论依据。     

杭白菊在开封地区的引种试验及利用

杭白菊是驰名中外的传统茶用菊,开封市农林科学研究院从其原产地浙江省桐乡市引进 3个杭白菊品种进行观测和试验。结果表明,杭白菊引种到开封后适应较好,确定最适宜开封地区种植的杭白菊品种为早小洋菊,最适宜繁殖方式为扦插繁殖,种植密度采取行距35 cm、株距30 cm为最佳,土地较肥沃可适当密植;并通过实生选种,从杭白菊后代中选育出一个表现优良的品种S18-2,对其物候期和主要表现性状进行了介绍。