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【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。 相似文献
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为探究温度对黑斑蛙蝌蚪生长发育和适应性的影响。将黑斑蛙蝌蚪分别在7、17℃和27℃驯化温度下饲养,测定体重、全长、尾长和体宽4个形态指标,分析各项形态指标的变化以及最适温度、逃避温度和致死温度的研究。结果显示,在饲养1~7 d期间,27℃组的体重、体宽、全长增长率均高于17℃组。在7、17、27℃驯化条件下,其最适温度分别是28.44、30.03、30.70℃;其逃避温度分别为25.49、31.77、31.78℃;其高温致死温度范围是38.0~40.5℃。综合结果分析表明,27℃是黑斑蛙蝌蚪比较适合的饲养温度,不同温度驯化后的蝌蚪,其最适温度有明显差异(P<0.05),逃避温度存在显著差异(P<0.01),而其高温致死温度没有显著差异性(P>0.05)。通过调节驯化温度,能够提高黑斑蛙蝌蚪对环境温度的适应性。 相似文献
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【目的】探讨不同质量浓度的左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响.【方法】在成熟培养液中添加不同质量浓度左旋肉碱,观察其对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,并利用油红染色、三酰甘油定量试剂盒和定量RT-PCR技术检测其对卵母细胞脂肪代谢及其关键水解酶表达水平的影响.【结果和结论】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉碱能极显著促进猪卵母细胞的脂肪滴代谢(P0.001),并显著提高猪卵母细胞体外成熟率和孤雌激活囊胚发育率(P0.05);在胚胎培养液中添加100 ng/mL左旋肉碱能够显著提高猪孤雌胚胎卵裂率(P0.05),其囊胚率和囊胚质量均有提高的趋势;通过定量RT-PCR进一步发现100 ng/mL左旋肉碱极显著降低猪卵母细胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL,P0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL,P0.001)的mRNA表达水平,表明左旋肉碱能够影响调控脂肪代谢关键酶基因的表达.试验结果表明,左旋肉碱具有促进猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的作用,其可能是通过调控脂肪代谢来实现的. 相似文献
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