盐藻钙依赖蛋白激酶基因DsCDPK的表达分析

以盐藻总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了盐藻DsCDPK基因的cDNA序列,将其克隆到pMD^TM19-T simple载体上,经测序获得的克隆片段全长1650 bp,与已发表的盐藻DsCDPK(GenBank:JQ964113)的编码区序列同源性达100%。将DsCDPK基因的开放阅读框与质粒pET-32a(+)连接,构建原核表达载体pET-32a-DsCDPK。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导融合,蛋白在大肠杆菌BL21中得到成功表达。通过SDS-PAGE检测发现,融合蛋白为部分可溶性表达,将上清蛋白经过His柱纯化后获得了纯度较高的可溶性融合蛋白,Western杂交检测显示,融合蛋白能被抗His单克隆抗体特异性识别,初步证明该融合蛋白就是带有His标签的DsCDPK蛋白。采用实时荧光定量PCR方法分析了高盐胁迫下DsCDPK基因的表达模式。试验结果表明,盐藻DsCDPK基因为盐胁迫上调基因,在高盐(3.0 mol/L NaCl)胁迫下,DsCDPK基因表达量显著增加,盐胁迫1 h时表达量达到最高,为正常生长状况(1.0 mol/L NaCl)下的3倍,差异达到极显著水平(P<0.01)。该研究成果为进一步阐明盐藻钙依赖蛋白激酶基因的功能及作用机制奠定了基础。     

利用免疫共沉淀联合质谱技术筛选盐藻MAPK的互作蛋白

为进一步探究杜氏盐藻促有丝分裂原活化蛋白激酶(DsMAPK)的功能,采用免疫共沉淀联合质谱技术筛选盐藻MAPK的互作蛋白。将pGS21a-MAPK质粒转入大肠杆菌BL21中表达MAPK蛋白并制备多克隆抗体;将培养至对数生长期的盐藻细胞进行盐胁迫处理,然后提取盐藻总蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;以内源性靶蛋白为诱饵,将细胞总蛋白与MAPK抗体进行共孵育,将经蛋白A/G琼脂糖珠纯化的免疫共沉淀复合物进行质谱检测。结果表明,制备的多克隆抗体特异性良好;筛选出165种特有的差异蛋白。通过GO和KEGG分析发现,这些差异蛋白主要参与了新陈代谢、遗传信息的传递以及信号转导等生物学调控过程。蛋白质互作网络分析发现,直接与MAPK相互作用的蛋白有4种。本研究结果为深入研究杜氏盐藻响应盐胁迫的分子机制提供了参考。