基于非理性设计的肺炎克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的分子定向进化

1,3-丙二醇是一种具有广泛应用前景和巨大市场潜力的平台化合物。在生物体转化甘油合成1,3-丙二醇的代谢途径中,甘油脱水酶是代谢途径的限速酶,然而自然界中的甘油脱水酶却存在着诸多的不足。本研究采用易错PCR技术对来源于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶进行非理性设计的分子定向进化,通过高通量筛选方法筛选获得了一个酶学性质得到了改善的突变酶γ-F97G。当以甘油作为酶催化的底物时,突变酶的酶比活力为（583.8±49.4）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约94%;当以1,2-丙二醇作为酶催化底物时,突变酶的酶比活力为（147.9±5.5）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约72%。经分析酶蛋白的三维结构后发现酶蛋白发生突变的位点属于远距离突变位点,实验结果表明远距离突变有时同样是一条优化和改善酶的酶学性质的好途径。     

丘状乳杆菌中二醇脱水酶激活因子pduGH的克隆与功能鉴定

以丘状乳杆菌（Lactobacilluscollinoides）基因组DNA为模版，通过PCR方法得到二醇脱水酶激活因子基因pduGH，连接到表达载体pET30a上，得到重组质粒pET—pduGH。将此重组质粒转化到Escherichia．coliRosseta（DE3）中进行表达，重组菌株SDS—PAGE结果显示有明显的64．5ku和12．4ku两条特异性蛋白。表达的目的蛋白大多为不溶性的包涵体，经变性、复性后得到部分可溶性蛋白。在辅酶B12，ATP，Mg^2＋或Mn^2＋存在下，以Clostridiumpasteurianum甘油脱水酶为对象进行激活实验，结果证实，重组质粒pET—pduGH的表达产物具有甘油脱水酶激活活性。     

大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达

以大肠杆菌E scherich ia coli K-12基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到假定的氧化还原酶(pu tative ox idoreductase)基因yqhD,将它连接到克隆质粒pGEM-3zf(+)上,得到重组质粒pGEM-yqhD,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,yqhD基因全长为1 164 bp。再将yqhD基因插入表达载体pSE 380,构建成重组子pSE 380-yqhD,并在E.coli BL 21中获得表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在30°C下,以1.0 mm o l/L IPTG诱导12 h的酶活力达到3.13 U/mL,比对照菌株提高4.4倍。     

宏基因组中不依赖辅酶B12甘油脱水酶基因的筛选和表达

通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3．3kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99％。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS—PAGE分析表明有88kD和34kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。