埃及伊蚊免疫应答相关基因mapk-like的dsRNA原核表达及其饲喂后表达水平的变化

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的dsRNA,本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli) HT115高效和廉价的优点,根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列,设计特异性引物,PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like (GenBank登录号：AAEL003728-RA),将其连接到克隆载体pMD18-T上,利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体pLitmus28i的2个T7启动子之间,成功构建可诱导形成目的双链RNA (dsRNA)的原核表达重组载体pLitmus28i-mapk-like,并转化大肠杆菌HT115,经IPTG诱导,1 mL菌液的dsRNA产量可达1.18μg,电泳检测条带清晰,质量良好。此外,利用壳聚糖包裹dsRNA形成纳米微粒,上清经电泳检测表明,壳聚糖的聚沉效率良好,纳米微球可有效防止dsRNA从饲料琼脂块中游离出来,提高dsRNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的dsRNA后,相对转录表达水平为65.55%,表达量明显下调,饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因,为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。