小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

雷公藤组培产物中雷公藤甲素和总生物碱含量的测定

建立了同一提取物中高效液相色谱法测定雷公藤甲素和紫外分光光度法测定雷公藤总生物碱含量的方法,样品用乙酸乙酯超声提取、过中性氧化铝柱,净化后用45%甲醇溶解,测定雷公藤的根皮、叶、雷公藤组培产物及培养液中雷公藤甲素和雷公藤总生物碱的含量。结果表明,雷公藤甲素的检测范围为1~100 μg/mL(R2= 0.999 9);雷公藤总生物碱在5~100 μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.999 8);在同一提取液中,雷公藤甲素和雷公藤总生物碱的添加回收率分别为100.5%(RSD=0.63%)和99.8%(RSD=1.22%)。研究结果表明,根愈伤组织中雷公藤甲素含量为根皮粉中的1.25倍,培养液中雷公藤甲素产量占56%,总生物碱产量占65%。每生产1 g不定根培养物,雷公藤甲素产量为根皮粉中的10倍,雷公藤总生物碱产量为根皮粉中的2倍。     

人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选

[目的]构建人SUMO1的真核表达载体,筛选SUMO1的有效干涉靶点。[方法]将SUMO1亚克隆至载体pCMV-HA中。寻找可能的干涉位点,合成上下游引物,退火后直接克隆入GFP-HU双启动子载体。用WesternBlot和细胞荧光的方法检测各载体对外源性SUMO融合蛋白表达的影响,其后检测对内源性SUMO1表达的敲降效果。[结果]构建的人SUMO1真核表达载体pCMV-HA-SUMO1测序正确。针对267、279、293、309、342、386等不同干涉靶点构建双启动子干扰载体,其中293位点的干涉载体在WesternBlot和荧光检测试验中均表现出稳定的敲降效果,抑制了SUMO1的表达。[结论]该研究成功构建了SUMO1的真核表达载体及具有明显敲降效果的干涉载体,可为后续研究奠定基础。