盐胁迫下宁夏枸杞Na+吸收及Na+/H+转运蛋白与H+-ATPase基因表达的研究

为从分子水平揭示宁夏枸杞钠的吸收积累机理,本试验采用原子吸收分光光度法和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对盐胁迫下宁夏枸杞根中Na⁺、K⁺含量以及质膜和液泡膜Na⁺/H⁺转运蛋白与H⁺-ATPase基因表达水平进行测定分析。结果表明,相同胁迫时间下,随着NaCl处理浓度的增加,枸杞根系中Na⁺浓度总体呈缓慢增加趋势,K⁺含量呈先增加后减少趋势,Na⁺/K⁺比值呈先减少后增加趋势;编码质膜和液泡膜的Na⁺/H⁺转运蛋白基因LbSOS1、LbNHX1以及液泡膜H⁺-ATPase基因LbVHA-C1表达量均呈升高趋势,质膜H⁺-ATPase基因LbHA1表达量呈先升高后降低趋势。相同NaCl处理浓度下,随着胁迫时间的延长,Na⁺含量总体呈增加趋势,K⁺含量呈先增加后减少趋势,Na⁺/K⁺比值呈增加趋势。LbSOS1、LbNHX1表达量总体呈先升高后降低趋势,LbVHA-C1、LbHA1表达量总体呈降低的趋势。相关性分析显示,不同胁迫时间下,枸杞根中LbSOS1、LbNHX1、LbVHA-C1和LbHA1表达量与Na⁺含量存在一定的正相关或负相关。上述结果表明,在低浓度NaCl胁迫时,维持枸杞体内较高的K⁺/Na⁺比值是宁夏枸杞耐盐的主要方式之一,同时也说明在胁迫初期,质膜和液泡膜的Na⁺/H⁺转运蛋白与H⁺-ATPase参与了枸杞细胞中Na⁺及时排出胞外和区隔于液泡,从而保持了根细胞内Na⁺的稳定性。此外,随着胁迫时间的延长和NaCl处理浓度的增加,LbSOS1、LbNHX1、LbVHA-C1和LbHA1的表达水平均降低,而 Na⁺积累量大幅增加,致使枸杞抗盐性降低。本研究揭示了宁夏枸杞的耐盐机理,为利用宁夏枸杞改良宁夏大面积盐碱地提供了理论依据。     

枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析

以"宁杞1号"枸杞为试材,通过RT-PCR及RACE技术进行枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析,并运用MEGA 5.0软件对植物转化酶基因进行了系统树分析。结果表明:扩增获得2 193bp的枸杞酸性转化酶基因,命名为LbSAI(GenBank:KC776575),该基因推导氨基酸序列与马铃薯、番茄、梨等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为68%~100%;LbSAI编码的蛋白质属于液泡酸性转化酶;Real-time PCR表达分析显示,LbSAI基因在枸杞花中表达量最高,在根中表达水平较低。     

聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较

聚合酶Ⅱ介导合成的外源短链RNA(short RNA,sRNA)可以竞争性地抑制内源mRNA的核质转运,推测共表达sRNA可以间接地提高病毒载体表达系统的表达效率.为了验证这一假说和评价其应用潜能,本研究采用基因体外合成技术和亚克隆技术,分别构建了聚合酶Ⅱ转录的拟南芥U6-1 RNA和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)编码的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressors,RSSs)2b的植物表达载体.以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)表达载体共接种寄主植物本氏烟(icotiana benthamiana),通过对报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的荧光观察,并以Western blot和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbnent assay, ELISA)测定GFP在烟草中的表达情况,分析sRNA对植物病毒载体表达系统的作用和可能的作用机制.同时通过与RSSs比较,评价sRNA在植物生物反应器中的应用潜能.实验结果表明,聚合酶Ⅱ转录的sRNA能有效地提高TMV病毒载体介导的外源基因在植物中的表达(GFP表达量比对照组高约2.5倍),而且能够显著地降低TMV诱导的病程相关蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,PR2)在细胞内的积累水平(PR2表达量比对照组下降约8倍).推测Ⅱ型启动子转录的sRNA通过竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的mRNA核质运转促进病毒RNA介导的外源基因在植物中的表达.此外,Ⅱ型启动子转录的sRNA的作用效果与CMV病毒编码的RNA沉默抑制子2b相当.研究结果为提高病毒载体介导的外源基因在植物中的表达提供了一条可供借鉴的思路.