甜瓜α-甘露糖苷酶基因家族的全基因组分析

琢-甘露糖苷酶(琢-mannosidases, 琢-Man)是生物界广泛存在的一种糖苷水解酶。通过已公布的甜瓜基因 组数据库预测琢-Man 基因家族成员,其蛋白序列都含有完整的Glyco_hydro_47 或Glyco_hydro_38 保守结构域。再将 筛选出的成员与拟南芥、大豆、番茄、可可树、葡萄、黄瓜、马铃薯、谷子的相应基因编码的蛋白序列进行进化分析比 对,建立系统发生树和保守基序的预测分析。结果表明,甜瓜基因组中含有8 个琢-man 基因,分为玉类和域类,并分 成5 个亚族。同一类成员的蛋白结构域具有较高相似性与保守性,并且大部分成员基序的顺序和种类相同,不同类 的成员之间基序差距较大。对甜瓜琢-甘露糖苷酶基因家族的系统分析鉴定,有助于甜瓜琢-甘露糖苷酶基因克隆和 功能的进一步研究,为研究其他植物琢-甘露糖苷酶基因家族的功能和进化提供参考依据。     

甜瓜α–甘露糖苷酶基因促进果实成熟功能的瞬时表达分析

 为了研究α–甘露糖苷酶（α-Man）基因在甜瓜果实成熟过程中的功能,应用农杆菌介导的瞬时表达技术,分别将含有甜瓜α–甘露糖苷酶基因超表达载体pPZP221-Man、两个RNAi载体pART-Man1和pART-Man2的农杆菌菌液注射至甜瓜绿熟期果实,通过观察果实成熟表型初步鉴定该基因的功能。结果表明,菌液浓度OD₆₀₀ = 1.2时果实表型比率最高,在果实蒂部表型居多。α–甘露糖苷酶活性测定结果显示,与非注射部位相比,注射超表达载体部位的组织α–甘露糖苷酶活性较高,而注射RNAi载体的组织α–甘露糖苷酶活性较低。RT-qPCR结果显示,与非注射部位相比,注射pPZP221-Man的部位α-Man基因表达约是对照的1.2倍,而注射pART-Man1和pART-Man2的部位α-Man基因的表达均有所下降,分别是对照的47%和37%。同时对甜瓜果实成熟相关的6个候选基因在注射部位的表达情况进行了分析,结果显示,这些基因在注射超表达载体的果实部位均上调表达;而在注射两种RNAi载体的果实部位均下调表达。这些结果表明甜瓜α–甘露糖苷酶基因在果实成熟过程中具有促进成熟的作用。     

通过花粉管通道法导入红树总DNA获得耐盐紫花苜蓿T0代植株及其RAPD验证

利用花粉管通道法将盐生植物红树总DNA导入紫花苜蓿,共导入1 391朵花,获得894粒T₀代转化种子。T₀代种子种植在含有225 mmol/L NaCl的MS培养基上,获得12株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照,对12株耐盐植株进行RAPD分析,在55条随机引物中有8条扩增出稳定、清晰的条带,条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失。以上结果初步证实外源DNA已经整合到受体的基因组中,而且T₀代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关。     

基于 cox1基因全序列的癞蝗科部分类群系统发育关系分析

该研究测定了我国癞蝗科7属11种昆虫细胞色素氧化酶 I（cox1）基因全序列,并联系从 GenBank下载的贺兰短鼻蝗、红缘疙蝗的 cox1基因全序列进行序列分析,结果表明,除宽纹蠢蝗外 cox1基因全序列均为1534 bp,其中有326个变异位点,211个简约信息位点;A+T平均含量为67.1%,碱基组成具有AT偏斜;遗传距离分析发现,遗传距离0.08可以将癞蝗科很好的分为4个组。以飞蝗为外群,用 NJ、MP、ML和贝叶斯法重建了癞蝗科的系统发育树,结果显示,锯癞蝗亚科的短鼻蝗属、突鼻蝗属、疙蝗属和贝蝗属4属8种蝗虫聚为一支,但短鼻蝗属的单系性未得到支持,癞蝗亚科的2种笨蝗聚为一支,蠢蝗亚科的宽纹蠢蝗为一支,与形态分类学将我国癞蝗科分为3个亚科的结果一致。锯癞蝗亚科的2种波腿蝗组成一支,没有和锯癞蝗亚科的其他种类聚在一起,波腿蝗属的分类地位有待进一步研究。     

东亚飞蝗储存蛋白基因LmiHex-2的克隆与表达分析

昆虫储存蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中发挥着重要作用。为分析东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis储存蛋白基因Lmi Hex-2的结构和时空表达特性,通过RACE技术获得了Lmi Hex-2基因2 171 bp全长c DNA序列,其中开放阅读框2 022 bp,编码673个氨基酸,预测分子量78.79 k Da。序列比对结果显示Lmi Hex-2基因c DNA序列与直翅目蝗总科储存蛋白基因c DNA序列的相似性达到82%~89%。RT-PCR结果显示Lmi Hex-2基因在东亚飞蝗卵和若虫阶段均有表达,5龄6 d时表达量最大;成虫中脂肪体表达量最高。通过贝叶斯法构建的系统发育树显示直翅目储存蛋白为单系群,昆虫血蓝蛋白与昆虫储存蛋白聚为姐妹群,二者均由甲壳纲血蓝蛋白进化而来。     

通过花粉管通道法导入红树总DNA获得耐盐紫花苜蓿T0代植株及其RAPD验证

利用花粉管通道法将盐生植物红树总DNA导入紫花苜蓿,共导入1391朵花,获得894粒T0代转化种子.T0代种子种植在含有225 mmol/L NaCl的MS培养基上,获得12株耐盐性强的植株.以供体和受体为对照,对12株耐盐植株进行RAPD分析,在55条随机引物中有8条扩增出稳定、清晰的条带,条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失.以上结果初步证实外源DNA已经整合到受体的基因组中,而且T0代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关.     

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35～45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。     

甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR2的克隆及其在果实发育成熟过程中表达特性的分析

为研究Cm-ETR2基因在甜瓜果实发育成熟过程中的作用机理,根据已报道的甜瓜(Cucumis melo)品种Cantalupensis的Cm-ETR2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cvHetao)成熟果实中克隆得到了乙烯受体基因Cm-ETR2 cDNA,序列分析显示,序列长度为2 304 bp,编码767个氨基酸。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对其在河套蜜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析,Cm-ETR2基因在15DAP至30DAP表达基本没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,且45DAP表达量为15DAP的9倍。     

甜瓜CmERFIV-3基因cDNA的克隆及功能初步分析

为了研究甜瓜ERF(ethylene-responsive factor)亚家族基因在果实成熟过程中的功能,本研究以甜瓜(Cucumis melo L.)品种河套蜜瓜为材料,克隆得到甜瓜ERF亚家组成员之一Cm ERFIV-3(MELO3C021306)基因c DNA,其开放阅读框(ORF)长为702 bp,编码233个氨基酸。分别构建了Cm ERFIV-3基因的超表达载体p PZPIV-3和RNAi载体p ARTIV-3,采用农杆菌介导的瞬时表达技术将含有重组质粒的农杆菌菌液注射到成熟期甜瓜果实中。结果显示,注射超表达载体的部位与对照相比,23.3%样品出现提前变黄的表型,而注射RNAi载体的部位与对照相比,20%样品出现持绿的表型。实时荧光定量PCR结果表明,注射超表达载体部位的目的基因的表达量是对照的2.37倍,而注射RNAi载体部位的目的基因的表达量是对照的0.24倍。这些结果初步表明Cm ERFIV-3基因参与甜瓜果实成熟过程。     

河套蜜瓜组织培养和再生植株比较研究

无菌条件下，河套蜜瓜种子在MS培养基中萌发生长5d－7d（天），取子叶近胚轴的下半段，转入愈伤组织诱导培养基（MS＋IAA1.0＋BA0.5）诱导产生愈伤组织，后转入芽诱导培养基（MS＋IAA0.8＋BA1.0＋ABA0.26）诱导生芽。待芽长到2cm(厘米）左右转入MS＋IBA0.5培养基中诱导生根，10d－15d（天）后再转入蛭石中，移入温室盆栽成苗，整个成苗过程约需60d-70d（天），再生植株诱导率达59％。