木薯MeCML24与MeSAUR1互作调控MeAGPS1a表达的功能验证

木薯是华南地区重要的经济作物,其块根富含淀粉。解析木薯块根淀粉合成调控机理将有助于木薯高产、高淀粉分子改良。AGPase由大亚基和小亚基构成,催化1-磷酸葡萄糖和ATP形成腺苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,其中腺苷二磷酸葡萄糖为淀粉生物合成的底物。AGPase酶是植物淀粉合成的限速酶,提高AGPase酶活性,有利于作物淀粉的积累及产量的提高。木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是AGPase的催化中心,前期研究表明生长素响应因子MeSAUR1作为转录因子正调控MeAGPS1a基因表达,酵母双杂交筛选木薯cDNA文库显示钙调素类似蛋白（CaM-like, CML）成员MeCML24为MeSAUR1的候选互作蛋白。为了确定MeCML24和MeSAUR1的互作关系,本研究从‘SC8’木薯品种基因组克隆了MeCML24基因,该基因的CDS区长度为492 bp,编码163个氨基酸。MeCML24蛋白的理化性质及二级结构分析显示,该蛋白理论等电点pI值4.38,属于亲水性蛋白,α-螺旋占52.76%,无规则卷曲占30.06%,β-转角结构占11.04%。构建酵母双杂交载体BD-MeCML24,自激活实验表...     

木瓜秀粉蚧为害对不同木薯品种次生代谢物质含量的影响

次生代谢物质在植物防御植食性害虫时发挥重要作用,但目前尚无次生代谢物质与木薯品种抗虫相关性的报道。本研究系统开展了木瓜秀粉蚧为害前后不同木薯品种叶组织中总酚、丙二醛、单宁等次生代谢物质含量的差异分析。结果表明,与为害前相比,木瓜秀粉蚧为害1、4、8 d后,感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’叶组织中总酚与丙二醛含量无显著差异,单宁含量则显著降低,而抗虫木薯品种‘缅甸’和‘C1115’叶组织中总酚和单宁含量显著增加,丙二醛含量显著降低。抗虫木薯品种的总酚含量在粉蚧为害前显著低于感虫木薯品种,而粉蚧为害1、4、8 d后显著高于感虫木薯品种;抗虫木薯品种丙二醛含量在为害前与感虫木薯品种无显著差异,粉蚧为害1、4、8 d后显著低于感虫木薯品种;抗虫木薯品种单宁含量在为害前后均显著高于感虫木薯品种。相关性分析发现,木薯对木瓜秀粉蚧的抗性与叶组织中总酚含量和单宁含量显著正相关,与丙二醛含量显著负相关。本研究初步阐明基于次生代谢物质总酚、丙二醛、单宁的木薯品种对木瓜秀粉蚧的抗性机理。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

番木瓜酸性转化酶基因家族预测及生物信息学初步分析

酸性转化酶参与了番木瓜果实中蔗糖的韧皮部卸载,调控果实中糖类的积累。本文利用番木瓜基因组数据库信息,发现了番木瓜基因组中含有6个酸性转化酶基因,分别为细胞壁转化酶基因（CpCWINV1-3）和液泡转化酶基因（CpVINV1-3）。这些基因由3-7个外显子组成,其中CpCWINV1、CpVINV1和CpVINV2的N端均具有一个跨膜区域。蛋白质3D结构预测分析表明,CpCWINV1、CpVINV1和CpVINV2具有典型的N端β-螺旋桨模块（β-propeller module）和C端β-三明治模块（β-sandwich module）,而CpCWINV3和CpVINV3的桨叶I上,均没有保守区NDPNG/A;CpCWINV2和CpVINV3均缺失了β-三明治模块。推测番木瓜细胞壁转化酶CpCWINV1、液泡转化酶CpVINV1和CpVINV2能正确履行催化蔗糖分解的功能。本研究有助于我们进一步揭示酸性转化酶在番木瓜果实发育及糖类积累过程中的作用。     

3个不同木薯品种的代谢产物解析

本研究以3种木薯品种（‘KU50’‘SC205’和‘SC9’）块根为实验材料,采用色谱-质谱联用非靶向代谢组学技术,对8月龄木薯块茎的代谢物进行差异性分析。通过鉴定共获得77个差异代谢物,主要涉及糖及其衍生物、氨基酸、有机酸等,‘KU50’和‘SC205’两个品种的优势代谢产物（相对含量>15%）均为蔗糖,且二者含量基本相当,‘SC9’的优势代谢产物为蔗糖与果糖;‘SC9’中蔗糖、柠檬酸相对含量显著低于‘KU50’和‘SC205’,但果糖、半乳糖、葡萄糖高于二者。利用主成分分析（PCA）发现,3个木薯品种块根代谢物组成结构差异性显著,获得差异显著的33种代谢物中主要涉及糖类及其衍生物、有机酸及其衍生物、生物碱、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等5个类别。通过GO、KEGG、通路富集分析共注释到14个差异显著性代谢途径,其中,共有16个代谢物富集于氨酰tRNA生物合成途径,9个富集于精氨酸和脯氨酸代谢途径,3个富集于氰基氨基酸代谢途径。本研究通过对3个木薯品种块根代谢物的种类、相对含量、主要代谢物和显著差异代谢物进行分析,阐明了不同木薯品种淀粉品质形成的物质基础。可为后期更好地进行木薯品种改良、品种选育及木薯食品加工提供参考。     

木薯MeSWEET10a基因启动子EBE区编辑载体的构建及验证

木薯细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）是由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis, Xam）引起的木薯重要病害,影响木薯产量,我国主栽的木薯品种均不抗Xam。Xam分泌的TAL20效应蛋白可结合木薯MeSWEET10a基因启动子的EBE区,激活该基因表达,促进糖类运输至Xam侵染的部位,为病菌的繁殖提供碳水化合物。本研究利用在线软件CRISPR-P v2.0设计EBE区的基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒pCAMBIA1301-Cas9-EBE-sgRNA。将重组质粒转化LBA4404根癌农杆菌,利用农杆菌介导法侵染木薯脆性胚性愈伤组织。提取侵染和未侵染的木薯脆性胚性愈伤组织DNA,PCR扩增靶点EBE区及潜在的脱靶位点,并进行Sanger测序分析编辑效果。结果发现EBE区被成功编辑,且没有脱靶现象。本研究有助于进一步获得MeSWEET10a基因启动子EBE区域的木薯突变体,以增强木薯抗细菌性枯萎病的能力。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

木薯MeRbohE基因的克隆及表达分析

从木薯中克隆了1个Rboh基因—Me Rboh E,该基因全长5 397 bp,开放阅读框2 775 bp,编码925个氨基酸,编码的蛋白分子量为104.8 KDa,理论等电点为8.90,蛋白结构具有典型的植物Rboh基因家族特征。q RT-PCR结果表明,Me Rboh E基因在木薯组培苗的根中表达量最高,茎中次之,叶中最低;在受到低温(4℃)、高盐(300 mmol·L-1Na Cl)和100 mmol·L-1ABA诱导后,表达量呈现不同程度的上调,表明该基因能应答非生物胁迫。     

木薯MeNOSIP与MeRbohD蛋白的互作验证及其对外源激素的响应

为了解木薯（Manihot esculenta）MeRbohD在抗病途径中的功能，笔者在获得MeRbohD候选互作蛋白MeNOSIP（nitric oxide synthase-interacting protein，一氧化氮合酶互作蛋白）的基础上，通过RT-PCR克隆获得MeNOSIP基因编码区序列，并进行生物信息学分析。结果表明，MeNOSIP的CDs序列全长918 bp，编码含305个氨基酸的多肽，属于不稳定的亲水类蛋白质，亚细胞定位预测MeNOSIP在细胞膜上表达。采用酵母杂交验证发现，MeRbohD与MeNOSI真实互作。MeRbohD和MeNOSIP在JA，SA，ABA诱导下基因均上调表达；ABA处理下，MeRbohD和MeNOSIP基因表达变化趋势一致，推测它们可能共同参与了由ABA介导的抗逆通路。