SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析.结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1 μmol/L和50 ng/μL.最佳PCR反应程序为:94℃预变性30 s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30 s,72℃延伸40 s,最后加做熔解曲线82℃1 s.结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因.本研究成功建立了2-△△CT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究.     

双斑长跗萤叶甲对几种植物挥发物的触角电位和行为反应

采用触角电位(EAG)、"Y"型嗅觉仪和风洞的方法研究双斑长跗萤叶甲成虫对14种植物挥发物的电生理和行为反应,筛选出对双斑长跗萤叶甲有效的植物挥发物,为该害虫的种群监测和防控提供新技术。研究结果表明:稀释102、103倍的薄荷精油和1 mol.L-1的香叶醇能引发双斑长跗萤叶甲强烈的EAG反应(P<0.01),且嗅觉测试表明,薄荷精油(稀释102倍)对双斑长跗萤叶甲的最大驱避率为(74±5.47)%,香叶醇(1 mol.L-1)对双斑长跗萤叶甲的最大引诱率为(70±10.00)%。风洞行为趋性研究表明:稀释102倍的薄荷精油对双斑长跗萤叶甲的最大驱避率为(72±8.37)%,而1 mol.L-1的香叶醇对双斑长跗萤叶甲的最佳引诱率为(66±8.94)%。     

SYBR Green I法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green I染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20 μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10 μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μM和50 ng/μL。最佳PCR反应程序为：94℃预变性30 s,44个循环包括94℃变性10 s,45℃退火30 s,72℃延伸40 s,最后加做熔解曲线82℃ 1 s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。