单核细胞增生李斯特菌 sRNA 伴侣分子 hfq的基因克隆、表达及纯化

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因，并纯化重组蛋白，通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因，将扩增产物克隆于pMD18-T载体中，测序验证后，再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中，成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，通过IPTG进行诱导表达，对表达蛋白进行可溶性分析，并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp，编码77个氨基酸，通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带；并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

基于3种线粒体基因的珠母贝属系统进化关系

为了研究珠母贝属的分类地位和系统演化情况,通过聚合酶链式反应技术(PCR)扩增并直接测序出雷州半岛珠母贝属中的马氏珠母贝、大珠母贝、珠母贝、斑珠母贝和黑珠母贝的3种线粒体基因(12S r RNA、16S r RNA和COⅠ)部分序列,分析其碱基组成和种间遗传距离。同时结合Gen Bank上发表的白珠母贝序列,构建珠母贝属的分子系统树。结果显示,5种珍珠贝的3种基因部分序列碱基AT含量大于GC含量,与其他无脊椎动物线粒体DNA序列基本一致,序列都处于高度饱和的状态。系统分析显示,构建的分子系统树与传统的形态分类基本一致。在黑珠母贝和白珠母贝亲缘关系上,3种线粒体DNA片段在碱基组成、种间遗传距离和系统进化树上都显示黑珠母贝和白珠母贝非常相近,可以认为是同一种中的2个亚种。在斑珠母贝的亲缘关系上,系统分析显示斑珠母贝与黑珠母贝和白珠母贝更为接近。研究表明,大珠母贝和珠母贝在系统进化中较早的分离出来,是一个比较原始的种类。3种分子标记对马氏珠母贝亲缘关系分析上存在一定差异,根据现有的数据尚不足以得出结论,需进一步做分子系统研究并结合形态特征和解剖结构进行分析。     

西方蜜蜂（Apis mellifera L.）sRNA的富集与文库检测

 【目的】提取及扩增蜜蜂（Apis mellifera L）sRNA,并构建文库检测富集结果是否满足高通量测序研究要求。【方法】取蜜蜂3个级型不同发育阶段个体作为材料,分别提取总RNA后混合,从中分离出15～40nt的sRNA,反转成cDNA后构建文库,进行蓝白斑筛选。挑选288个单克隆进行测序,对测序结果进行分析。【结果】有效序列为214条,插入的cDNA片段大小范围为15～39 bp。其中,sme-miR-71c miRNA 65条,ncRNA（包括tm-RNA、intron_ghI、5.8s rRNA）5条,tRNA 28条,siRNA及其他sRNA 33条, CDS 1条,未知序列82条。【结论】本实验采用的方法能有效富集蜜蜂sRNA,能够满足高通量测序从中识别出蜜蜂miRNA的研究。     

sRNA SaaS对沙门氏菌粘附响应规律和胞外代谢物的影响效应

sRNA SaaS (Salmonella adhesion associated sRNA)是近期在肉品源肠炎沙门氏菌(S. Entertidis NCM 61)中筛选出的一种新型调控因子。本研究通过对比野生株与SaaS缺失突变株的粘附响应规律,分析二者胞外代谢物的差异以揭示sRNA SaaS的具体功能及可能的作用机制。结果显示,sRNA SaaS对肠炎沙门氏菌粘附能力的影响具有温度依赖性。在37℃下,SaaS 能够抑制该菌在不锈钢、玻璃和聚丙烯表面形成生物菌膜,且在聚丙烯表面的抑制作用尤为明显。进一步通过广泛靶向代谢组学分析发现,sRNA SaaS可能分别从菌体细胞数量和胞外多聚物产量两方面抑制肠炎沙门氏菌生物菌膜的形成。本研究结果有助于完善生物菌膜的理论体系,为研发生物菌膜新型控制技术提供新思路。     

利用小RNA深度测序快速鉴定草莓病毒

病毒侵染直接影响草莓的生长发育及果实品质,快速检测及鉴定病毒是病毒防治的前提。本研究以‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓为试材,利用小RNA(sRNA)测序结合RT-PCR技术对2种栽培草莓品种中存在的病毒进行了研究。对sRNA测序结果进行组装和注释,结果表明:在混合样品中共有242个contigs比对到5种草莓病毒,分别为草莓白化病毒(strawberry pallidosis associated virus,SPaV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓毛形病毒3(strawberry crinivirus 3,SCrV 3)和草莓毛形病毒4(strawberry crinivirus 4,SCrV 4)。利用RT-PCR技术对sRNA测序结果进行验证,结果表明:SMoV、SVBV和SCrV 3在‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓中均检测到,而SPaV和SCrV 4只在‘哈尼’草莓样品中检测到。本研究利用sRNA测序技术鉴定了2个草莓品种中存在的病毒,首次在我国生产的同一个草莓品种中检测到5种病毒,为草莓病毒的检测和防控提供了新的思路。     

犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

为快速、准确检测犬巴贝西虫病,根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列,设计合成1对特异性诊断引物,建立了PCR诊断方法。结果扩增出了犬巴贝西虫18sRNA基因的一段大小为319bp片段,经测序,所扩增序列与报道的序列完全匹配。同时对附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品进行扩增没有出现扩增条带。阳性犬全血DNA稀释1 000倍后,依然可以有效地检测出虫体DNA。结果表明,所建立的PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性,可以运用于临床检测巴贝西虫病。     

Virome identification in wheat in the Czech Republic using small RNA deep sequencing

High-throughput deep-sequencing technology and bioinformatics analysis of the small RNA(sRNA) population isolated from plants allows universal virus detection and complete virome reconstruction for a given sample. In the present sRNA deep-sequencing analysis of virus-infected wheat samples in the Czech Republic, samples were firstly tested for barley yellow dwarf viruses(BYDVs), wheat streak mosaic virus(WSMV) and wheat dwarf virus(WDV) using ELISA, RT-PCR and PCR. Subsequent sRNA sequencing of these samples yielded more than ～60 million single-end 50-bp reads with high confidence for nine field samples of wheat. Overall, 16.5% of reads were virus-specific and 83.5% were mapped to the host. More 21-nt reads(～7.7 E+06 reads) were found than 24-nt(～6.20 E+06 reads) or 22-nt(～4.30 E+06 reads) reads. De novo assembly of the high-quality contigs revealed the presence of three earlier reported viruses in the Czech Republic: BYDVs(31.48%), WSMV(24.23%) and WDV(26.66%). We also showed the presence of cereal yellow dwarf virus(14.33%; two species CYDV-RPS and CYDV-RPV(family Luteoviridae/Polerovirus) and wheat yellow dwarf virus(WYDV, 3.30%; Luteoviridae). Phylogenetic analysis showed CYDV and WYDV grouped separately from BYDVs. Furthermore, several recombination breakpoints were found among the groups of yellow dwarf viruses(BYDVs, CYDV, and WYDV). Using RNA deep sequencing, we confirmed the presence of the three known viruses(BYDVs, WSMV, and WDV) and the first record of two species of CYDV and WYDV in wheat in the Czech Republic.     

木薯sRNA 测序分析及其开花相关 microRNA的挖掘

为研究木薯花序与叶片中 sRNA 表达特性，探索 microRNA 对其开花过程的调控。本研究以木薯品种“华南八号”花序和幼叶为材料，利用 RNA-seq 技术进行 sRNA 测序分析；并筛选开花相关 microRNAs 进行表达特性分析。从花序和幼叶测序结果中分别获得 12 092 109 条和 11 499 655 条 sRNA 序列。花序中筛选出 139 条已知 microRNAs 和253 条新预测 microRNA，分别预测得到 992 和 3 736 条靶基因；幼叶中筛选出 134 条已知 microRNA 和 191 条新预测microRNAs，分别预测得到 979 和 2 603 条靶基因。最终筛选出 8 种与开花调控相关和 3 种花色调控相关的 microRNAs。表达分析显示，miRNAs 在两样品间呈现出较大的整体性差异，并且在功能与代谢通路上也不尽相同；开花相关microRNAs 中表达差异较大的为 miR156、miR172 和 miR169，其中 miR156 表达量在花序中高于幼叶，而 miR172 表达量在花序中低于幼叶，推测其功能为抑制后续的开花过程，避免过度开花。本研究分析了木薯花序与幼叶中 sRNA的整体特性，通过表达差异分析初步明确了 microRNAs 对木薯开花的调控，为进一步深入探索奠定了基础。     

植物响应低温胁迫转录组测序研究进展

低温胁迫是限制植物生长发育和地理分布最主要的环境因子之一,影响植物细胞膜系统、抗氧化系统、光合作用、次生代谢等诸多方面,对农业生产和发展有严重影响。因此,揭示作物在冷胁迫下的生理及分子机制是十分必要的,这有助于培育耐寒作物品种,从而减少生产损失,扩大作物种植面积,具有重要的生产价值和经济效益。目前,基于RNA-seq技术进行植物低温胁迫分子机制深度解析在拟南芥、水稻、油菜、茶树、小麦、烟草、高粱等重要作物上得到了发展应用。本研究综述了近年来植物在低温胁迫或低温适应过程中的转录组学研究现状,以期为高通量测序技术在植物抗性研究方面提供方法借鉴和理论基础。