家蚕Ras3基因全长cDNA克隆及在感染BmNPV家蚕组织中的表达谱分析

Ras(rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白是GTPase超家族成员之一,该蛋白质可以将细胞外信号传导到不同的细胞,从而调控细胞的吞噬作用、凋亡、抗微生物侵染的酶防御系统等生理过程.运用RACE技术,从家蚕中肠中克隆出一个新的BmRas3基因,该基因cDNA全长987 bp,包含5'UTR(153 bp)、3'UTR(279 bp)和一个编码184个氨基酸残基的ORF(555 bp).BmRas3具有小G蛋白的典型特征,其氨基酸序列中含有3个GTP/GDP结合结构域,1个效应子结合结构域以及1个烯丙基化的CAAX基序.多重比对发现BmRas3与海波斯莫科马属蛾(Hyposmocoma kahamanoa)Rap1、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)Rap-1b、烟草天蛾(Manduca sexta)Rap1的序列相似性较高,系统进化分析也显示BmRas3与这些蛋白质的亲缘关系最近.BmRas3在食桑期的表达量高于眠期;在感染BmNPV的家蚕中肠和脂肪体中,BmRas3的表达量有不同程度提高,且与正常对照相比差异显著,暗示BmRas3可能作为免疫活化因子,在家蚕抵抗BmNPV的入侵过程中发挥着重要作用.研究结果为下一步探讨BmRas3对BmNPV感染的应答提供了理论基础.     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用。该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况。绵羊WNT5A基因的CDS区全长1062 bp,编码353个氨基酸。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。RT-qPCR研究结果表明,WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。WNT5A基因在绵羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织中均广泛表达,其中在皮肤中的表达量高于其他组织(P<0.05),而在脾脏中表达量较低。它在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05),而在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05),在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)。该结果为深入研究绵羊WNT5A基因的功能提供了重要依据,同时也丰富了绵羊基因组内容。     

大豆GmRLP19基因克隆及胁迫应答模式分析

以大豆品种Williams82为试验材料,克隆GmRLP19基因,通过生物信息学分析qPCR检测探讨该基因不同生育期品种、不同组织、不同非生物胁迫下表达模式。结果表明,该基因编码区全长3 138 bp,编码1 045个氨基酸,编码蛋白具有胞外信号肽,LRRNT域,富含亮氨酸重复结构域,跨膜结构域和一段胞内短肽,属于受体类蛋白家族,定位于质膜。该基因在不同生育期品种间差异表达,在豆和豆荚中特异性表达,且在5种非生物胁迫中均有响应。研究为探究WRKY20基因功能及挖掘和完善基因调控通路奠定基础。     

体细胞克隆荷斯坦奶牛出生后死亡犊牛内脏器官的组织病理学观察

为探究体细胞克隆荷斯坦奶牛出生后死亡的原因,对新生后死亡的克隆荷斯坦公牛和自然繁殖的荷斯坦公犊的主要组织器官进行比较。通过解剖和石蜡切片-HE(hematoxylin-eosin staining)染色技术,对主要的组织器官结构进行观察和分析。结果表明,新生后死亡的克隆荷斯坦公牛肺部结构清晰;肝脏的肝细胞明显肿大,出现脂肪轻度变性;肾小管上皮细胞出现变性;心肌的肌纤维间空隙增大;骨骼肌纤维间隙明显,空泡变性,这可能导致该克隆牛犊肌肉无力并功能不全;淋巴结皮髓质界限不分明,淋巴小结细胞较稀疏,生发中心不明显,淋巴窦细胞较少;脾脏内红细胞较少,这说明该克隆牛的造血功能可能不完善;胸腺的皮质部分和髓质部分界限不明显,嗜酸性胸腺小体不易辨认,可能发育不全。该克隆公牛免疫器官出现不同程度的发育不全现象较严重,这有可能是其出生后死亡率高的主要原因。     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能，并对其进行生物信息学分析，检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物，PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序，利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示，草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp，编码464个氨基酸，其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%），与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄，分子质量为50.924 ku，理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50，氨基酸残基多数为亲水性残基，总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明，Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中；磷酸化位点分析发现，Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%），三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示，Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高，在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性，其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定，属于水溶性蛋白，在线粒体和内质网中发挥作用，在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。