长期取食染镉小麦后中华稻蝗体内镉的累积分布

重金属镉在动物体内的代谢过程主要通过消化途径实现。以食物染毒的方法,采用不同浓度镉溶液培养的麦苗饲喂中华稻蝗（从一龄若虫至成虫）,将中华稻蝗成虫不同组织部位（头、翅、足、卵巢／精巢、体壁、前肠、中肠、后肠）解剖,并通过原子吸收分光光度计测定其镉的浓度,统计分析各组织部位镉的累积分布规律。火焰原子吸收测定结果表明,生长于浓度为0、36．67、73．34、110．01、146．68μg·g^-1镉溶液中的小麦,其叶片中镉的累积浓度分别达到1．99、102．88、159．92、255．48、372．68μg·g^-1,与培养液中镉浓度呈显著正相关（Y=2．4379X-0．206,R^2=0．988P〈0．01;Y为小麦中镉浓度,X为镉溶液浓度）;随着镉处理浓度的增加,中华稻蝗头、翅、足、卵巢、体壁、前肠、中肠、后肠中镉的累积浓度基本都呈增加的趋势,例如,在各组织部位中镉累积浓度最高的为中肠,4个处理浓度中雌虫分别为对照组的139．29、82．11、197．94、212．74倍,雄虫为对照组的99．89、70．32、100．17、91．23倍;在各组织部位中镉累积浓度较低的足,雌、雄虫也分别达到了对照组的4．95、8．80、16．23、16．90倍和7．14、12．22、20．59、27．98倍。对中华稻蝗成虫各组织部位镉累积浓度进行比较发现,消化道各部位的累积浓度较其他部位为高,其中,中肠内镉的累积浓度均为最高,前后肠间的累积浓度次之;此外,镉在中华稻蝗头部也有明显的累积,其次是体壁和翅,而卵巢／精巢和足的累积浓度最低。研究结果表明长期取食染毒小麦可导致镉在中华稻蝗体内的累积,且镉在不同组织部位中的累积分布存在差异。     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。     

三种重金属对中华稻蝗金属硫蛋白基因表达的影响

以栖息于稻田且主要取食水稻茎叶的中华稻蝗(Oxya chinensis)成虫为供试材料,经氯化镉、氯化铜和硫酸锌(Cd Cl2、Cu Cl2和Zn SO4)3种重金属急性染毒,采用RT-q PCR技术检测中华稻蝗2个金属硫蛋白基因(Oxya chinensis metallothionein,Oc MT1,Oc MT2)在精巢、卵巢和肌肉中的表达变化。结果表明,3种重金属均可诱导中华稻蝗MT基因不同程度的上调表达。经Cd急性处理后,3个器官组织中Oc MT1和Oc MT2表达水平在一定浓度范围内随着Cd浓度的增高而诱导表达上调;经Cu急性处理后,精巢和卵巢中Oc MT1在最低浓度时的诱导表达量最高,Oc MT2表达水平随着Cu浓度的增大而升高,肌肉中2个MT基因随着Cu浓度的增大而升高;经Zn处理后,Oc MT1和Oc MT2表达水平随着Zn浓度的升高而升高。由实验结果可以看出,3种重金属对中华稻蝗MT在不同器官组织均有诱导表达作用,但各浓度处理后其诱导表达水平不同,Oc MT对不同重金属的敏感性具有显著差异。     

镉长期暴露对中华稻蝗抗氧化机制的影响

采用生长于Cd2＋污染条件下的小麦苗喂养中华稻蝗的慢性染毒方法,研究了Cd2＋胁迫对中华稻蝗SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度的影响。结果表明,在Cd2＋的作用下,中华稻蝗体内SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度均发生变化,表明Cd2＋可导致中华稻蝗体内产生ROS。SOD、CAT、GPx3种酶对Cd2＋有一定的耐受性：当Cd2＋浓度在这3种酶的耐受范围内,酶活性提高,反之酶活性降低。Cd2＋与抗氧化系统间的关系复杂,SOD、CAT、GPx共同承担清除ROS、保护中华稻蝗的重要作用。     

病原真菌降解两种蚧虫体壁过程中胞外酶作用

【目的】探究病原真菌降解蚧虫体壁过程中胞外酶的作用及其毒力效应,为应用病原菌对蚧虫进行生物防治提供依据。【方法】选用4株昆虫病原真菌-蜡蚧霉（Lecanicillium lecanii）菌株V3.4505、V3.4504、噬菌蚧霉(L. fungicola)菌株HEB02和镰刀菌Fusarium incarnatum-equiseti菌株HEB01,以日本龟蜡蚧（Ceroplastes japonicus Green）和沙里院褐球蚧（Rhodococcus sariuoni Borchsenius）为靶标害虫,以这两种蚧虫的表皮作为病原菌培养基的唯一碳源,测定培养过程中各菌株4种胞外酶的活性变化,包括脂肪酶、类枯草杆菌蛋白酶（Pr1酶）、几丁质酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶）,并据此分析真菌入侵蚧虫体壁过程中胞外酶的作用。同时,测定两种蚧虫被4株病原真菌感染8 d后的死亡率,用于评价菌株和胞外酶的毒力效应。【结果】4株病原菌在降解两种蚧虫的体壁过程中,4种胞外酶的活性都发生了明显的变化,呈现先升高后降低趋势。脂肪酶的活性高峰出现得最早,在培养2 d后就达到最大值,且在日本龟蜡蚧上各菌株脂肪酶的活性明显高于沙里院褐球蚧。菌株的Pr1酶活性高峰出现在3-4 d,而几丁质酶和NAG酶的活性高峰分别出现在6 d和4-5 d。4个菌株相比较,V3.4505菌株对日本龟蜡蚧和沙里院褐球蚧的致死率均为最高,分别是73%和81%,且与HEB02菌株和HEB01菌株有差异显著。4个株菌的Pr1酶活性平均值与它们对日本龟蜡蚧和沙里院褐球蚧感染8 d后累计死亡率的线性相关性显著,线性方程分别为：y=0.082x+5.822（R²=0.823）和y=0.119x+14.75（R²=0.764）;4个株菌的几丁质酶活性平均值与两种蚧虫累计死亡率的线性相关也较显著,线性方程分别为：y=-0.148x+15.89（R²=0.645）和y =0.095x+10.46（R²=0.762）。【结论】在对两种蚧虫的感染过程中,病原真菌的4种胞外酶均参与了对蚧虫蜡质和体壁的降解。脂肪酶降解虫体表面的蜡质,酶活性高峰出现最早,在蜡壳厚的日本龟蜡蚧上其酶活性表现得更高。在其余3种酶中,先由Pr1酶作用,降解蚧虫原表皮中的蛋白质,再由几丁质酶和NAG酶作用,降解几丁质。酶作用高峰时间与酶活性大小与其底物在蚧虫体壁中的排列层次与含量相吻合。菌株的酶活性和蚧虫致死率相关性分析说明,Pr1酶和几丁质酶可作为菌株的毒力指示因子。4个菌株相比较,蜡蚧霉V3.4505菌株表现出较好的致病特性,说明其对蚧虫的毒力较高,可考虑作为蚧虫生物防治应用的病原菌种。     

中华稻蝗羧酸酯酶家族基因生物信息学及组织表达特异性分析

【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。     

长尾仓鼠SSR位点的筛选与扩增

利用从山西省11个地市共计13个县(市)野外捕捉的132只长尾仓鼠为试验材料,先提取其基因组DNA,然后应用查阅的近源种黑线仓鼠的6对SSR位点引物(已登记在GeneBank)对长尾仓鼠基因组DNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明,有5对引物扩增效果较好,可用于长尾仓鼠的遗传多样性研究。研究结果可对今后长尾仓鼠的遗传多样性分析提供一定的理论基础。     

飞蝗几丁质酶5-1抗体制备及表达特性分析

【目的】通过制备飞蝗（Locusta migratoria）几丁质酶5-1（LmCht5-1）的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA 软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗cDNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体pET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到pET32a-OVA载体构建pET32a-OVA-LmCht5-1;将pET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21（DE3）中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射dsLmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471-533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 kD;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射dsLmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射dsLmCht5-1和dsGFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。dsLmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。     

铬在中华稻蝗（Oxya chinensis）体内的累积及对抗氧化系统的影响

昆虫体内的重金属主要是通过消化途径实现代谢过程的。本文中以不同浓度六价铬（Cr6＋）溶液（0、7.5、15、30mg·L^-1）培育的小麦对中华稻蝗（Oxya chinensis）从4龄若虫开始进行慢性染毒,待其发育到成虫时分别测定虫体、粪便、小麦叶片内的Cr含量以及成虫体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和总抗氧化能力（T-Aoc）。结果显示,生长于0、7.5、15、30mg·L^-1Cr6＋溶液中的小麦,其叶片中Cr浓度分别为5.77、6.85、9.88、18.33μg·g^-1。随着Cr6＋浓度的增加,虫体内和粪便中Cr的累积量也逐渐增大,在30mg·L^-1时达到最大值。中华稻蝗体内SOD活力随着处理浓度的增加,变化不明显,未达到显著水平。而CAT、GPx活力和T-Aoc随着处理浓度的增加,呈先升高后降低的趋势,在7.5mg·L^-1时达到最大值。本文结果表明,中华稻蝗体内的Cr含量随着染毒浓度的增加而增大,是对环境中重金属Cr污染的一种间接反应。通过测定中华稻蝗体内的Cr含量,可以对环境中Cr污染进行评估;同时,中华稻蝗抗氧化酶系统在机体防御过氧化物损伤方面起着重要作用。     

飞蝗载脂蛋白对卵巢发育和脂质沉积的影响

【背景】脂质是生物体重要营养素之一,对于昆虫滞育、飞行、胚胎发育和能量调节至关重要。载脂蛋白（apolipophorin,apoLp）是昆虫脂蛋白颗粒的蛋白质部分,主要负责组织之间脂质转运。【目的】以世界性农业害虫飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象,通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对其载脂蛋白生物学功能进行分析,探究载脂蛋白在飞蝗卵巢脂质运输中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】利用RNAi技术,分别对羽化后第1天（1 PAE,post adult eclosion）的成虫2个载脂蛋白基因（LmapoLp-II/I和LmapoLp-III）进行dsRNA注射,以ds GFP为对照,每头注射15μg dsRNA;分别解剖羽化后第4、6、8天的卵巢进行观察;取羽化后第8天的卵巢,以EF1α作为内参基因,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测沉默效率;利用脂质组学技术测定并分析对照和沉默LmapoLp-II/I后飞蝗卵巢脂代谢物差异,采用OPLS-DA模型的差异倍数（FC）、P值和VIP值相结合的方法筛选差异脂质;制备冰冻...