枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备及再生条件研究

以枸杞内生真菌Fusarium nematophilum NQG8Ⅱ4菌株为材料，利用单因素试验和响应面法对影响原生质体制备的4个因素（菌龄、酶解时间、酶质量浓度、稳渗剂浓度）进行优化，获得原生质体制备的最佳条件。确定酶解时间，酶质量浓度，稳渗剂浓度三因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。结果表明，NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件为：过滤收集菌龄16 h的菌丝0.05 g于 1 mL质量浓度为30.30 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5 h；以0.713 mol/L NaCl为稳渗剂，原生质体产量平均为7.12×107 mL^-1，再生率平均为5.56%，有效原生质体量平均为39.59×10mL^-1，与模型预测值拟合较好。获得枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件，为该菌株在原生质体诱变、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学研究提供理论基础。     

宁夏地区葡萄卷叶伴随病毒遗传变异的PCR-SSCP分析

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病病株率较高,严重影响了酿酒葡萄产业的健康发展,但有关其病原葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus, GLRaVs)的遗传变异情况则鲜有报道.利用RT-PCR技术对宁夏酿酒葡萄不同种植区的7个主栽品种的GLRaV-1和GLRaV-3进行分子检测,利用SSCP技术对扩增片段进行遗传变异分析.试验结果共获得8个GLRaV-1和13个GLRaV-3的阳性样本. 8个GLRaV-1分离物基于CP基因分析差异明显,可分为3类; 13个GLRaV-3分离物基于RdRp基因分析差异明显,可分为3类,而基于CP和HSP70基因分析可分为2类.说明宁夏酿酒葡萄不同种植区、不同品种的GLRaV-1和GLRaV-3种群分子特性存在差异且遗传变异明显.这有助于宁夏地区酿酒葡萄GLRaVs流行学调查和分子诊断分析,为该病害的防控提供理论依据.     

枸杞深色有隔内生真菌定殖规律及其与土壤因子的相关性

利用采自宁夏银川市金凤区和西夏区两个枸杞栽培区0~20、20~40和40~60 cm共3个土层深度的枸杞根系和根围土样，研究枸杞 (Lycium barbarum)根系深色有隔内生真菌 (dark septate endophytes，DSE)的定殖规律及其与土壤因子的相关性，以期为充分利用DSE资源和基于生物技术促进荒漠植被恢复和生态改良提供依据。结果表明，DSE可定殖于枸杞根系形成深色、有隔菌丝，微菌核多呈聚合型和离散型。两样地DSE定殖率差异显著，金凤区样地DSE平均总定殖率（73.27%）显著高于西夏区样地 （23.54%）；不同土层DSE定殖率有差异，两样地DSE总定殖率、菌丝定殖率和微菌核定殖率最大值均出现在20~40 cm土层。两样地不同土层深度间土壤因子的分布差异显著，主成分分析显示pH、碱解氮、速效磷、有机质、碱性磷酸酶和蔗糖酶能综合反映银川市两枸杞样地根际土壤养分状况。方差分解分析结果表明，DSE定殖受到样地和土壤因子的共同影响。相关性分析表明，DSE定殖在两样地间存在较大差异，金凤区样地DSE总定殖率与有机质显著正相关，与速效钾极显著负相关；DSE菌丝定殖率与有机质、速效磷和碱解氮显著正相关，与速效钾和pH显著负相关。西夏区样地DSE总定殖率和微菌核定殖率与pH极显著正相关；DSE菌丝定殖率与有机质、速效磷和脲酶显著负相关。上述结果说明，枸杞根系能被DSE侵染，DSE定殖具有明显的垂直空间异质性，并与土壤因子密切相关。     

深色有隔内生真菌S12菌株遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

【目的】建立深色有隔内生真菌（dark septate endophyte,DSE）的遗传转化体系,获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的DSE转化子,为研究DSE在植物根系的侵染定殖行为和侵染定殖规律奠定基础。【方法】以前期从健康枸杞根系分离的1株DSE菌株枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）S12菌株为供试材料,确定潮霉素B对其的最低抑制质量浓度,然后研究菌龄（13,15,17,19和21 h）、酶解时间（1.0,1.5,2.0,2.5,3.0和3.5 h）、崩溃酶质量浓度（10,15,20,25,30和35 mg/mL）和渗透压稳定剂种类（NaCl、KCl、CaCl2和MgSO4）对S12菌株原生质体制备的影响。采用聚乙二醇（PEG）介导原生质体转化法将PDL2质粒（含hph和gfp基因）转入S12菌株,对所获转化子进行表型、GFP荧光、PCR及拮抗活性（以尖孢镰刀菌枸杞专化型Fusarium oxysporum f. sp.Lycium barbarum LR-1菌株为靶标菌）检测,筛选与野生型S12菌株无明显差异且带有GFP标记的转化子。【结果】S12菌株在YPD液体培养基中培养17 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,用30 mg/mL的崩溃酶酶解2.5 h,原生质体制备数量最多,为4.53×10⁶ mL^-1。通过PEG介导,将PDL2质粒（含hph和gfp基因）转入S12菌株,可得47株转化子,转化效率2.35株/μg,从中筛选出10株生长速度和产孢量与野生型S12菌株无明显差异的转化子。荧光观察、PCR和拮抗活性检测结果表明,外源基因已成功整合到S12菌株中,成功建立了S12菌株的遗传转化体系,并获得了GFP标记菌株,有6株转化子对LR-1菌株的抑菌率与野生型S12菌株无明显差异。【结论】成功建立了遗传稳定性良好的S12菌株遗传转化体系,筛选出了6株抑菌效果与野生型菌株相当的转化子。     

PEG介导枸杞内生真菌NQ8GⅡ4遗传转化及转化子评价

通过聚乙二醇（PEG）介导原生质体转化法将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达载体转入枸杞内生轮状镰刀菌（Fusarium nematophilum）NQ8GⅡ4菌株中，通过生物学测定和PCR检测，获得与野生型NQ8GⅡ4菌株无明显差异的转化子57株，转化效率（单位质量的DNA转化子数）为2 850 株 • mg-1。通过遗传稳定性、表型、荧光性、拮抗性和致病性对比，获得1株与野生型NQ8GⅡ4菌株无差异的转化子。该转化体系的建立为枸杞内生真菌在宿主植物中的侵染定殖规律和生防作用研究奠定基础。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白表达载体的筛选

【目的】筛选适合枸杞内生真菌（Fusarium nematophilum）NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体,为后期研究该菌株在宿主植物中的侵染行为和定殖规律奠定基础。【方法】采用PEG介导原生质体转化法,分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG转入NQ8GⅡ4菌株,对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性,筛选GFP标签蛋白的最佳表达载体。【结果】枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B（HmB）的耐受质量浓度为20 mg/L,对遗传霉素（G418）的耐受质量浓度为80 mg/L。通过PEG介导原生质体转化,获得pFL2转化子272株、pDL2转化子57株、r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株,其转化效率分别为13.60,2.85,3.65和11.30株/μg。荧光显微观察发现,表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r KNT和pFL2的转化子。连续培养5代后,pDL2转化子的遗传稳定率高达89.47%,pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率分别仅为67.28%,68.49%和58.85%。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的拮抗活性以及对枸杞离体叶片的致病性均与野生型菌株无明显差异。【结论】pDL2更适合用作NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体。     

嗜线虫镰刀菌NQ8GⅡ4对枸杞根腐病的防效及其机制研究

为明确内生真菌嗜线虫镰刀菌（Fusarium nematophilum）NQ8GⅡ4菌株对枸杞根腐病的防效及作用机制,利用平板对峙法测定其对枸杞根腐病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycium barbarum）菌丝生长的抑制作用,通过盆栽试验测定对枸杞根腐病的防治效果,并采用防御酶活性测定和组织化学染色分析其作用机制。结果表明,预先3 d接种NQ8GⅡ4菌株能显著抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长,抑制率高达70.07%。拌土法接种NQ8GⅡ4菌株可显著降低温室中枸杞根腐病的发生,防效为76.38%,与化学药剂多菌灵防效相当。接种NQ8GⅡ4菌株显著促进枸杞生长,株高、侧枝数、叶宽、茎粗和根长分别比对照增加了37.61%、90.56%、52.50%、32.35%和44.69%。在病原菌胁迫下,接种NQ8GⅡ4后21 d与不接种相比POD、SOD、PAL和CAT活性分别增加33.92%、65.64%、57.96%和41.59%,MDA含量减少44.23%。说明接种NQ8GⅡ4菌株可以促进枸杞幼苗生长,激发植株体内防御酶活性,缓解病原菌胁迫导致的膜脂过氧化作用,进而提高...     

苦豆子内生真菌诱导子促进宿主生物碱合成积累的生理防卫反应

分别以4株苦豆子内生真菌菌液浓缩物为诱导子，研究不同诱导时间下，各诱导子对苦豆子组培苗中氧化苦参碱（OMA）含量以及防御酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性的影响。结果显示：4种苦豆子内生真菌的菌液浓缩物均可提高宿主中OMA的积累，其中诱导效果最佳的是内生真菌诱导子XKYKDF₄₀，在0~15 d诱导期间宿主中OMA含量持续增长且始终高于对照，在诱导第15 d达到最高，为3.616 mg·g^-1，是同时期对照组的2.09倍。4种内生真菌诱导子还可诱发宿主中生物碱合成关键酶PAL和3种抗氧化酶（POD、APX和CAT）活性升高。诱导子XKYKDF₄₀激发PAL活性的作用最佳，在诱导第6 d PAL活性达最大值，为61.92 U·g^-1，是同时期对照组的1.42倍；与其他诱导子相比，诱导子XKZKDF₂₇能够明显诱发POD的活性，在诱导第12 d达到最大值，为62.30 U·mg^-1，是同时期对照组的2.70倍；诱导子XKZKDF₁₁可诱导宿主中的APX和CAT活性大幅度提高，在诱导第12 d酶活性达到最高，分别为0.5538 U·mg^-1和19.82 U·mg^-1，是同时期对照组的4.97倍和3.00倍。结果表明，苦豆子内生真菌诱导子的加入不仅激活了宿主组培苗的防御性应答反应，还促进了OMA的合成。     

枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力

为了明确枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用,通过室内抑菌试验和离体试验测定了内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用及对枸杞炭疽病的防治效果。结果表明,镰刀菌属Fusarium菌株NQ8GII4、NQ8GII7、NQ7GII4和篮状菌属Talaromyces菌株NQ6GIII11对胶孢炭疽菌有明显的拮抗作用。平板对峙试验显示,上述4株枸杞内生真菌具有较强的营养和空间竞争能力,菌株NQ8GII4对病原菌的抑制率高达93.43%。显微观察发现,枸杞内生真菌能缠绕并穿透胶孢炭疽菌菌丝,使胶孢炭疽菌菌丝膨胀崩解。菌株NQ7GII4的培养滤液在浓度为15%时对病原菌菌丝的抑制率达到70.75%,菌株NQ8GII7产生的挥发性物质对胶孢炭疽菌抑制率高达83.44%。离体生防试验结果表明,用拮抗性内生真菌预先占位接种枸杞嫩果及叶片,能有效抑制枸杞炭疽病菌的侵入和病斑的扩展,菌株NQ8GII4 10%培养滤液对枸杞炭疽病的防治效果最强,防效达到了92.54%和95.57%,说明枸杞内生真菌具有很好的生防潜力和应用前景。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4定殖促生作用研究

为进一步明确内生生防菌NQ8GⅡ4在宿主和非宿主植物中的定殖能力和促生作用,采用生物学方法测定野生型NQ8GⅡ4菌株的促生潜力;利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的NQ8GⅡ4-GFP菌株,对枸杞、番茄、小麦、西葫芦、生菜和芹菜等6种植物进行灌根处理,利用激光扫描共聚焦显微镜观测NQ8GⅡ4-GFP菌株在宿主和非宿主植物中的定殖情况,同时检测不同接种浓度对枸杞苗生长的影响。结果表明,野生型NQ8GⅡ4菌株在5 d时赤霉素浓度可达16.6μg/mL,并具有一定解磷、产铁载体、纤维素酶和蛋白酶的能力。NQ8GⅡ4-GFP菌株能定殖于枸杞、番茄和小麦的根部,不能定殖于芹菜、生菜和西葫芦。不同植物定殖率有明显差异,在宿主植物枸杞根部定殖率最高,为93.9%,在非宿主植物番茄根部定殖率为91.84%,而在小麦根部定殖率仅为21.43%。不同接种浓度下对枸杞苗生长指标影响不同,其中以10⁵～10⁶ CFU/mL孢子液灌根,对枸杞苗促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。