纳米标记免疫层析法在农药残留检测中的应用研究进展

农药残留超标已成为影响农产品质量安全的重要问题,迫切需要探寻开发灵敏、准确、可靠、便捷且适用性强的农药残留快速检测方法。免疫层析法是将抗原抗体特异性免疫反应和色谱层析分离技术相结合的一种快速检测方法,其中,基于胶体金标记的免疫层析技术以其便捷、成本低、可视化等优点而受到普遍欢迎。近年来随着量子点、时间分辨荧光微球、上转换发光纳米粒子等新型纳米标记材料的出现,免疫层析技术得到了广泛发展。文章从标记类型（非共价作用标记及共价作用标记）及标记材料（胶体金、纳米碳、量子点、上转换发光纳米粒子、磁性纳米颗粒、时间分辨荧光微球及荧光乳胶颗粒）等方面,综述了不同纳米材料标记的免疫层析技术及其在农药残留检测领域的研究及应用进展,可为深入开展农药残留免疫层析技术研究提供参考。     

抗对硫磷单链抗体在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体scFv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR方法串联拼接获得单链抗体基因片段(scFv-4C6)。构建包含目的片段的重组杆粒Bacmid-scFv-4C6,转染Sf9细胞表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)检测表达产物,间接竞争酶联免疫吸附(ic-ELISA)法评价产物的生物活性。结果表明:scFv-4C6基因片段拼装正确,成功转染Sf9细胞,并在转染后72 h表达量最高,表达的单链抗体大小为28.3 kD;表达产物能特异性识别对硫磷,IC50值为7.9 ng/mL,对甲基对硫磷和杀螟硫磷分别有12%和1.8%的交叉反应率,与亲本单克隆抗体的识别性能相似。该研究表明,具有生物活性的抗对硫磷单链抗体scFv-4C6可在昆虫细胞中成功得到表达。     

水稻病原菌Burkholderia plantarii群体感应和群体淬灭研究进展

植物伯克霍尔德菌Burkholderia plantarii是引起水稻秧苗细菌性立枯病的重要病原菌之一,其侵染性、繁殖力及适应性均很强,严重威胁中国水稻生产。文章围绕B.plantarii的发生、危害及致病机理,着重论述了细菌群体感应系统(quorum sensing,QS)的生理功能及其在B.plantarii致病力调控方面的最新研究进展,并进一步从根际微生物互作角度,综述了种间信号分子对病原菌群体淬灭(quorum quenching)的作用机制,同时结合种间信号分子的独特性,展望了其在新型微生物杀菌剂研发中的重要性和应用潜力。     

啶虫脒金标免疫速测试纸条研制及其在茶叶中的应用

阐述了一种基于直接竞争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条的研制方法,及其在茶叶中快速检测与诊断啶虫脒残留的应用情况。通过制备啶虫脒人工抗原,获得了高灵敏度的单克隆抗体,抗体效价大于1:10000。据此研制的金标速测试纸条对啶虫脒肉眼判断的检出限为10ng/mL,检测时间为10min;可特异性地检测茶叶(绿茶、红茶、铁观音)中烟碱类农药啶虫脒的残留量,而对其他烟碱类农药(吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺等)无交叉反应,能满足中国茶叶中啶虫脒最大残留限量(0.5mg/kg)下的检测要求,具有灵敏度高、使用便捷、结果准确、成本低等优点。该技术可以实现成品茶样品中啶虫脒的现场快速测试诊断。     

化学发光酶联免疫分析法同时检测3种有机磷农药残留

利用能同时识别对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的宽谱特异性单克隆抗体,建立了同时测定这3种有机磷农药残留的化学发光酶联免疫分析方法（chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA）,比较了间接竞争（ic-CLEIA）和直接竞争（dc-CLEIA）2种反应模式,优化了相关理化参数,确立了最适反应条件。结果表明:间接竞争CLEIA法检测对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的抑制中浓度（IC₅₀）分别为5.57、2.30和2.62 μg/kg,检测线性范围分别为0.39~100、0.39~25和0.39~25 μg/kg;直接竞争CLEIA法检测对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的抑制中浓度（IC₅₀）分别为5.43、1.34和1.24 μg/kg,检测线性范围分别为0.39~100、0.10~25和0.10~25 μg/kg。所建立的CLEIA方法基本能满足对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷在谷物和果蔬中最大残留限量的检测要求,为研制有机磷农药多残留检测试剂盒提供了技术依据。     

动物源食品中氯霉素残留速测金标试纸条的研制

应用杂交瘤技术制备了抗氯霉素单克隆抗体,并根据竞争式胶体金免疫层析试验原理,研制了氯霉素检测免疫试纸条。研究结果表明,该单克隆抗体对氯霉素的亲合性好,特异性高;该金标试纸条适用于动物源食品中氯霉素残留的快速检测,对虾肉、蜂蜜样品的最低检出限为1.5μg/kg,对鲜奶的最低检出限为3μg/kg,检测时间只需5-8min。     

抗噻虫嗪重组全长抗体的制备与特异性识别机制研究

本研究旨在制备抗噻虫嗪的重组抗体,并采用计算机辅助的同源建模和分子对接的方法解析抗体和噻虫嗪的特异性分子识别机制。首先,采用表面等离子共振技术评价了抗噻虫嗪单克隆抗体的识别性能;其次,以抗噻虫嗪杂交瘤细胞株为基因来源,经分子克隆获得了抗体可变区序列,由哺乳动物细胞HEK 293(F) 体外表达成功获得了全长重组抗体;最后,基于正确的可变区序列,采用同源建模和分子对接手段,研究了抗体高亲和力特异结合噻虫嗪的分子识别机制。结果表明,抗噻虫嗪单克隆抗体可特异性识别噻虫嗪,且与其具有较高的结合亲和力 (解离平衡常数K_D = 7.995 × 10?11 mol/L)。由HEK 293(F) 体外表达的全长重组抗体,采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法进行评价,表明该重组全长抗体对噻虫嗪的IC₅₀值为0.41 μg/L,与其他新烟碱类农药的交叉反应率 < 0.04%,表现出与亲本单克隆抗体一致的性能,即具有高特异性、高灵敏度的识别活性。分子对接计算结果表明,位于疏水结合口袋参与形成范德华力的8个氨基酸残基和参与形成氢键的Asn39 (L-CDR1) 残基与抗体的选择性 (特异性) 相关,位于重链CDR区的两个氨基酸His35(H-CDR1) 和Trp108(H-CDR3) 残基决定了抗体对噻虫嗪的结合亲和力。该研究制备的重组全长抗体可代替传统单克隆抗体建立多种免疫检测方法,应用于环境样品和农产品中噻虫嗪的残留检测。解析的噻虫嗪抗原抗体分子识别机制,可为后续改造更高亲和力的抗体提供理论依据。     

氯霉素速测金标试纸条及其保护剂配方研究

 【目的】研制出一种适合于氯霉素残留快速测定的金标试纸条,并对该试纸条的保护剂进行研究,使得研制出的试纸条保存期足够的长。【方法】根据竞争性金免疫层析法原理,研制了氯霉素速测金标试纸条,并选择了蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、牛血清蛋白（BSA）、表面活性剂Tween20、防腐剂等物质,采用经验尝试法配制了一系列的配方,对试纸条不同部位进行处理,通过37℃和60℃下热稳定性测试,并与未经稳定剂处理的对照进行比较,筛选出适宜的试纸条保护剂。【结果】经该复合保护剂处理的氯霉素速测金标试纸条,在4℃、37℃和60℃下分别保存180 d、30 d和10 d,显色基本不变,对于标准溶液,其检测灵敏度（目测）可达到1.5 ng?ml-1。未经该复合保护剂处理的氯霉素速测金标试纸条,在4℃、37℃和60℃下保存60 d、3 d和1 d后就迅速失活,无法用于检测。【结论】 研制出的氯霉素金标试纸条检测灵敏度较高（对于添加样品,检测灵敏度为0.75～1.5 ng?ml-1）,经保护剂处理后,4℃下至少可保存半年。     

动物源食品中氯霉素残留速测金标试纸条的研制

应用杂交瘤技术制备了抗氯霉素单克隆抗体,并根据竞争式胶体金免疫层析试验原理,研制了氯霉素检测免疫试纸条。研究结果表明,该单克隆抗体对氯霉素的亲合性好,特异性高;该金标试纸条适用于动物源食品中氯霉素残留的快速检测,对虾肉、蜂蜜样品的最低检出限为1.5μg/kg,对鲜奶的最低检出限为3μg/kg,检测时间只需5～8min。