玉米暗形态建成突变体的筛选

双子叶植物的下胚轴和单子叶植物的中胚轴的生长模式是暗形态建成和光形态建成的重要标志性发育事件,黑暗促进其延伸,而光照则抑制其生长。拟南芥下胚轴的形态建成受光信号通路与植物激素途径中许多重要基因的调控,这些基因在农作物中的同源基因,往往也与许多重要的农艺性状有关。基于此,以玉米的中胚轴在暗形态建成中的长度作为表型标记,从EMS突变体库中(包含6 150份郑58背景株系和2 340份B73背景株系)筛选获得96株中胚轴长度异常的突变体。进一步对其中两个突变体进行了初步分析,发现这两个突变体在BR信号途径发生缺陷。玉米暗形态建成突变体的获得将不仅有助于解析玉米对光信号的应答,而且有助于揭示光信号通路与其他信号途径的互作。     

玉米转录因子EREB58启动子分析

玉米EREB58转录因子能够调控萜类合成酶基因TPS10的表达,启动玉米抗虫间接防御体系。但是目前对于EREB58的转录调控机制还是未知。克隆得到EREB58基因的1 193 bp的启动子序列,通过生物信息学分析发现在启动子序列中存在多个与植物防御相关的顺式作用元件,如ABRE、Box-W1、GARE motif和TCA元件。将不同长度5’端缺失的启动子与GUS报告基因相连构建植物表达载体转化拟南芥,转基因拟南芥进行GUS组织化学染色和GUS酶活性分析,结果显示:正常情况下EREB58PF1-PF7和PF9无GUS染色,但PF8有GUS染色;Me JA或亚洲玉米螟处理后PF1-PF7有GUS染色,PF8无明显变化,PF9仍无GUS染色。GUS酶活性分析与GUS组织化学染色结果一致。以上结果表明:EREB58启动子的-323至-270和-270至-183区段是启动子的功能区段,且-323至-273区段含有抑制EREB58基因转录的顺式作用元件,-273至-183区段是EREB58基因转录所必需的,这为后续研究EREB58的转录调控机制奠定基础。     

转cry2Ah-vp基因玉米的抗虫性鉴定

为获得新型抗虫转基因玉米,将通过群体筛选获得的具有抗虫性的转cry2Ah-vp基因玉米VP1-5采用PCR、Southern blot、实时荧光定量PCR(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法进行阳性植株鉴定、拷贝数分析、转录水平和翻译水平分析,同时通过室内和田间生物活性测定鉴定转基因玉米VP1-5对东方黏虫Mythimna separata和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的抗性。结果表明,在转基因玉米VP1-5中cry2Ah-vp基因已整合到玉米基因组,以单拷贝的形式插入;cry2Ah-vp基因在转基因玉米VP1-5不同部位组织中均可以正常转录,在灌浆期叶片中的mRNA表达量最高,相对表达量为32.67,在灌浆期穗轴中的mRNA表达量最低,相对表达量为3.74;Cry2Ah-vp蛋白在转基因玉米VP1-5的6叶期各组织中表达量均较高,其中在叶片中的表达量达到2 155.18 ng/g FW,在抽雄期花丝中的表达量最高,达到2 165.86 ng/g FW;且转基因玉米VP1-5对东方黏虫有很高的杀虫活性,接虫3 d后幼虫死亡率达到100.00%;对亚洲玉米螟幼虫也有明显的生长抑制作用。表明转基因玉米VP1-5可作为玉米抗虫育种和害虫防治的种质资源。     

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps 导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2，采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中，对Tn代1542株植株进行草甘膦喷洒实验，共得到32株能够耐受0．25％草甘膦药液的抗性植株；对这32株抗性植株的PCR检测结果表明，其中29株为PCR阳性植株，平均转化率为1．88％；Southern杂交和Western杂交检测结果证明mG2-epspps基因已整合至玉米基因组并正确表达。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的获得及其遗传稳定性分析

Btcry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）分离株BT8中克隆鉴定的新型杀虫蛋白基因。研究利用该基因构建了植物表达载体pHUAh,用基因枪法转化玉米杂交组合Q31×Z31的胚性愈伤组织,得到13株阳性转基因玉米（Zea mays L.）植株。通过生物活性分析筛选得到了2个高抗转基因事件B1-1和B1-7,对其T1～T5代转基因植株进行了5代跟踪检测,结果表明,外源基因在玉米植株可以稳定表达,并且可以逐代稳定遗传。利用ELISA对不同转化事件以及同一转化事件不同组织部位的Cry1Ah蛋白的表达量进行分析,发现该基因在不同转化事件之间以及同一转化事件不同组织部位表达量都存在差异。对T2～T5代转基因植株田间虫测结果显示,转基因玉米对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）具有显著的抗性,且逐代稳定遗传。B1-1和B1-7有望成为Bt抗虫玉米育种工作的备选材料。     

农杆菌介导甜高梁转Bt cry1Ah的研究

[目的]建立一套高效、稳定的甜高梁农杆菌遗传转化体系,并在甜高梁中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性.[方法]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高梁品种"BABUSH"和"MN-3025"中.对获得的再生植株进行 PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析.[结果]对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%.RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T.甜高梁转基因植株中能够正常转录.Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69ng·g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng·g,-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng·g-1FW.饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性.[结论]利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究.     

转Bt cry1Ah/2mG2-epsps双价基因抗虫/耐除草剂玉米研究

构建了含有Bt杀虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps的双价植物表达载体pMAGUHM,通过基因枪轰击Q31×Z31杂交组合的胚性愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记,通过1mmol/L草甘膦异丙胺盐筛选,获得T0代转化植株80株,其中PCR检测有36株为阳性植株,阳性率达45%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,证明外源基因已整合到玉米基因组中并正确表达。草甘膦及玉米螟抗性检测结果表明,有5个转基因品系表现出具有耐草甘膦和抗虫的双重特性。     

双抗夹心ELISA方法检测转cry8Ca基因烟草的杀虫蛋白

为了检测转cry8Ca基因烟草的杀虫蛋白，建立了双抗夹心ELISA检测体系。确定多克隆抗体浓度为1:3200，酶标结合物浓度为1:400，pH 9.6碳酸缓冲液提取，pH7.4磷酸缓冲液包被，0.5%明胶-PBST封闭，TMB底物作用15min为最佳双抗夹心ELISA检测条件。采用这一检测体系，对转cry8Ca基因烟草植株进行检测，S12株系中的植株Cry8C蛋白含量最高，每克鲜重含有12.683-14.461ug，占总蛋白量的0.052%-0.062%。     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。