莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）在江苏省莲藕产区普遍引起发病，并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况，针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R，通过优化引物浓度和退火温度条件，构建标准曲线，建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测技术。该方法特异性强，可以快速检测出SPLV-lotus，灵敏度为普通PCR的100倍，可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析

本研究以采自山东省栖霞市的两个苹果样品为试验材料,利用二维电泳、斑点杂交、RT PCR等分子生物学技术对样品中的苹果锈果类病毒(ASSVd)带毒情况进行了检测。结果表明：两个样品均携带ASSVd。对两个样品中的ASSVd进行克隆测序,并利用生物学软件DNAMAN对所得序列进行分析,结果表明：与世界上首次报道的ASSVd序列(X17696)相比,本研究所得到的ASSVd序列变异较小,相对比较保守。     

快速灵敏的甘蔗线条花叶病毒免疫学检测体系的建立

 甘蔗花叶病广泛存在于我国甘蔗种植区,严重影响甘蔗产业的高质量发展。近年来甘蔗线条花叶病毒在蔗区肆虐,尽管针对其的血清学检测技术已经建立,但是快速、准确、高通量的检测方法亟待发掘。本研究制备了^SCSMVCP的抗血清,特异性高,与引起甘蔗花叶病的另两种病原 (高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒) 间没有血清学交叉反应。基于该多克隆抗体,建立了直接抗原包被的ELISA、斑点杂交、Western blot和基于多抗的免疫试纸条检测技术。开发的免疫试纸条检测技术能快速、准确、高通量应用于田间病毒鉴定。本文提供了基于血清学的快速、准确、高通量,且便捷的甘蔗线条花叶病毒检测技术,有助于我国蔗区甘蔗花叶病的监测与防控。     

雀麦花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

正雀麦花叶病毒(brome mosaic virus,BMV)为正义单链RNA病毒。BMV寄主范围广泛,在波兰等地均有发现(Trzmiel et al.,2015),大多危害禾本科、豆科、茄科等植物,感病植株常表现出褪绿、轻微花叶症状。因此,为减轻BMV造成的经济损失和丰富BMV的检测方式,本研究拟构建BMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达BMV的外壳蛋白,制备高特异性和高灵敏度的抗血清,以期用于BMV的有     

河南温县地黄上瓜类褪绿黄化病毒的鉴定及其CP序列分析

<正>0引言地黄(Rehmannia glutinosa Libosch．)为玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物,根部为传统中药材,主要产区分布在山东、山西、河南、河北、北京等地。地黄栽培中通常使用块根进行无性繁殖,易导致病毒病积累发生,从而严重影响地黄的产量与质量^[1]。目前侵染地黄的植物病毒主要有烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus,ReMV)、油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)、车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,P1AMV)等^[2]。     

甘蔗线条花叶病毒P1蛋白基因原核表达及抗血清制备

甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展。建立快速有效的检测方法对于SCSMV的防控有着重要意义。本研究依据SCSMV P1基因序列合成一对引物,扩增获得1 074 bp的目的基因,将目的基因与原核表达载体pET28a连接,获得pET28a-P1^SCSMV。将连接正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测显示在分子量约为42 kDa处有目的蛋白带,与预期的SCSMV P1大小一致。融合蛋白主要是以可溶性蛋白的形式存在。利用镍柱亲和纯化重组的SCSMV P1蛋白,并免疫健康新西兰大白兔,制备兔抗血清。Western blot分析显示,在对多个样品进行检测时制备的抗血清能特异性地识别SCSMV的P1蛋白,在受SCSMV侵染的甘蔗植株中能检测到P1蛋白的表达,而在健康植株中检测不到P1蛋白的表达。制备的抗血清稀释至1∶20 000时仍能特异地检测到目的蛋白条带,说明通过大肠杆菌表达P1制备的SCSMV...     

甘薯潜隐病毒莲藕分离物辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒莲藕分离物sweet potato latent virus-lotus(SPLV-lotus)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR从感病莲藕样品中扩增获得SPLV-lotus辅助成分-蛋白酶基因(HC-Pro),大小为1 375 bp。通过序列测定和分析后,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导并纯化获得大小为74 kD的融合蛋白pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得过量表达。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,采用ELISA和Western blot对抗血清效价和特异性进行检测,当HC-Pro抗血清稀释比为1∶256 000时,ELISA显色后OD450读数仍高于0.6,表明所制备抗血清合格;Western blot结果显示,在感染SPLV-lotus植株样品中仍能检测到单一目的条带。这些结果表明,制备的抗血清效价合格且可用于SPLV-lotus的特异性检测。     

植物病毒混合侵染研究进展

混合侵染是病毒为害作物时存在的一种普遍现象,给农业生产带来严重威胁,并常造成重大的经济损失。目前,已报道了多种病毒混合侵染的相关研究。本文综述了近年来对植物病毒混合侵染现象以及内在机制的研究现状,从基因沉默抑制子、小RNA、进化博弈等方面探讨了影响植物病毒混合侵染的因素,以期为病毒病害的有效防控提供依据。     

侵染牡丹的烟草脆裂病毒的检测鉴定及序列分析

为明确江苏省牡丹上烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)的发生情况,利用ELISA和RT-PCR方法对采集自扬州市的40份牡丹叶片样品进行了检测鉴定,测定了其中一个分离物Peony-11中TRV RNA1分子的部分蛋白编码区序列,并结合Gen Bank中已报道的相关序列对其进行了多样性和系统发生分析。结果显示,江苏省扬州市牡丹上TRV的检出率高达62.5%;序列分析表明本研究获得的TRV牡丹分离物Peony-11与Gen Bank中其它63个分离物的核苷酸序列一致率为90.5%~99.7%;系统发生和遗传距离分析表明TRV可以分成2个组10个亚组,组间、亚组间具有较为清晰的地理和寄主特异性,其中Peony-11分离物位于亚组I-1。