可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

葡萄溃疡病菌巢式PCR高效检测体系的建立

葡萄溃疡病（grape canker）在世界葡萄种植区普遍发生,可引起葡萄的顶梢枯死、枝干溃疡、果实腐烂等症状,严重时可导致植株整株死亡,给葡萄生产造成严重危害[1]。已知葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae中的17个种可引起葡萄溃疡病[1]。     

葡萄灰霉病菌对3种杀菌剂的多重抗药性检测

【目的】为检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威3种杀菌剂的多重抗药性,指导生产上葡萄灰霉病的药剂防治。【方法】从甘肃、山东、北京等14个省、市、自治区采集葡萄灰霉病样分离纯化得到109个灰葡萄孢(Botrytis cinerea)单孢系菌株,采用最低抑制浓度法(MIC)测定了葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类(多菌灵)、二甲酰亚胺类(腐霉利)和氨基甲酸酯类(乙霉威)杀菌剂的多重抗药性。【结果】结果表明,葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威的抗药性菌株率分别达到了83.5%、14.7%和17.4%;抗药性类型有BenRDicSNPCS、BenRDicRNPCS、BenRDicRNPCR和BenSDicSNPCR4种,所占比例分别为68.8%、13.8%、0.9%和16.5%。【结论】我国不同地区的葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和氨基甲酸酯类杀菌剂普遍存在抗药性问题,对多菌灵的抗药性较为严重,因此,在生产上,应选择一些替代的新型杀菌剂和生物农药。     

可可毛色二孢菌侵染后的烟草酵母双杂交cDNA文库构建

正葡萄是世界上最重要的经济果树之一,据联合国粮食及农业组织统计,截止到2013年,中国葡萄栽培面积已达715.5万hm2,葡萄总产量超2 300万kg。长期以来,葡萄病害是影响葡萄产业健康发展的重要因素。近年来研究发现由葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病     

葡萄溃疡病菌转化子致病力快速评价体系的建立

为探索快速、稳定、高效的葡萄溃疡病菌转化子致病力评价方法,分别采用无伤接种、昆虫针针刺接种、打孔器打孔接种等3种接种方法,将随机选取的来自葡萄溃疡病菌REMI转化子库的50株转化子分别接种‘富士’苹果果实和‘夏黑’葡萄一年生绿枝条,测量病斑大小.结果表明,用葡萄绿枝条接种能区分不同转化子的致病力,而苹果果实则仅能将致病力减弱的转化子筛选出来.在葡萄绿枝条上致病力减弱的转化子有96.15％在‘富士’苹果果实上的致病力也是减弱的,而用苹果果实接种未筛选到致病力增强转化子.上述结果为获得致病力突变体奠定了基础.     

番茄黄化曲叶病毒的鉴定与群体进化分析

番茄黄化曲叶病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)是番茄上的重要病害,可由多种双生病毒引起。为了明确北京地区番茄黄化曲叶病的病毒种类和病毒基因组变异情况,本研究收集了51个采自北京不同区县的病毒疑似样品,进行了双生病毒的检测及分离物的基因组分析。经双生病毒简并引物检测25个样品呈阳性;扩增获得10个代表性分离物的全基因组,大小均为2 781bp,共含有6个开放阅读框;经比对,10个分离物与Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)同源率大于99%;基于我国TYLCV分离物全基因组序列的变异分析表明,TYLCV在进化上比较保守,整个基因组上的变异是不均匀的;系统发育树显示我国TYLCV分离物在进化树上可分为3个组群,分析了我国TYLCV群体进化情况。     

河北省番茄黄化曲叶病毒病的分子鉴定初报

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链病毒,目前双生病毒病害已在多个国家和地区的作物上造成严重危害。近年来,我国多省报道作物上有这类病毒的发生,且有逐年加重和扩散的趋势。根据危害番茄的双生病毒DNA A序列保守区设计简并引物,对2009年4月采自河北省魏县表现叶片黄化、曲叶症状的4个番茄样品进行PCR检测,均为双生病毒阳性,对样品的扩增片断进行了克隆测序,经序列比对分析,与番茄黄化曲叶病毒（Tomato leaf curl virus,TYLCV）山东分离物（FJ646611.1）序列相似性为99.25%~99.55%,说明河北番茄黄化曲叶病由TYLCV引起。     

甘蓝枯萎病菌原生质体的制备与再生条件的优化

建立甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans）高效遗传转化体系的途径之一是获得其具有再生功能的原生质体。本研究通过对甘蓝枯萎病菌菌丝摇培时间、菌丝的酶解时间、保护原生质体的渗透压稳定剂的种类和浓度等因素进行优化,建立了制备甘蓝枯萎病菌原生质体的高效、稳定体系,并在SR固体培养基上实现了甘蓝枯萎病菌原生质体的再生,再生率可达21.13%。该体系的获得将为下一步甘蓝枯萎病菌高效遗传转化体系的建立和致病机理的解析奠定基础。     

胶东半岛地区葡萄病毒病田间调查和血清检测

2008年8—9月对胶东半岛葡萄主产区15个葡萄园的病毒病发生及危害情况进行了田间调查,采集了4个酿酒葡萄品种共计44份葡萄样品,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行病毒血清学检测。从样品中分别检出葡萄斑点病毒(GFKV)、葡萄卷叶病毒1(GLRaV-1)和葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3),检出率分别为6.82%、2.27%和40.91%。蛇龙珠样品中3种病毒均被检出,总检出率达60.71%;赤霞珠样品中检出了葡萄卷叶病毒3和葡萄斑点病毒,总检出率为36.46%。蓬莱地区葡萄样品中3种病毒均被检出,检出率达55.56%,龙口地区病毒检出率也达到了52.17%。     

葡萄白粉病抗性鉴定方法优化及品种抗性评价

本研究通过对叶盘保湿方法的改进, 不同菌源接种后发病严重度的分析, 抗?感病对照品种的确定, 建立了一种更为便捷?可靠?稳定的葡萄白粉病室内抗性鉴定方法:取葡萄藤自上而下第2~4片幼嫩叶片, 打取直径15 mm的叶盘置于1.5%水琼脂平板进行保湿, 采集田间菌源直接制备孢子浓度为2×105个/mL的孢子悬浮液接种, 选定抗?感病葡萄品种做对照, 14 d即可完成抗性鉴定?采用此方法对11个葡萄品种(品系)进行了葡萄白粉病抗性评价, 结果表明:供试的11个品种(品系)对葡萄白粉病的抗性存在明显差异, 其中高感品种为‘巨峰’‘夏黑’和‘阳光玫瑰’等, 感病品种为‘玫瑰香’和‘马瑟兰’, 抗病品种为‘瑞都科美’和‘无核翠宝’, 高抗品种为‘北冰红’?试验结果为葡萄抗病品种的选育及利用提供了方法和基础参考数据?