油萝卜抗胞囊线虫基因的染色体定位及其在油菜附加系中的稳定性

 【目的】油萝卜（2n=18，9条染色体分别被称作a～i）具有抗甜菜胞囊线虫的基因。探索油萝卜携带的抗甜菜胞囊线虫基因所在的染色体和外源的油萝卜染色体在油菜中的遗传稳定性。【方法】9个油菜附加系进行自花受粉，分别获得附加系的自交F2代。利用筛选的分子标记检测和原位杂交（FISH）检测附加染色体在F2代中的遗传稳定性；通过对9个油菜附加系F2代接种甜菜胞囊线虫的2龄幼虫，鉴定携带抗甜菜胞囊线虫基因所在的染色体。【结果】9个附加系自交F2代中的附加染色体遗传表现不一，5个油菜附加系的F2代中均有2条附加染色体,能稳定遗传；4个附加系的自交后代中附加染色体的遗传表现不稳定，部分后代中无附加染色体。FISH检测9个附加系自交F2代中的附加染色体表明：与分子标记检测的结果相符，并且4个不稳定的附加系中，有的自交后代虽然有附加染色体，但有1或2条。接种甜菜胞囊线虫测定结果表明，含有油萝卜染色体DD的油菜附加系对甜菜胞囊线虫的抗性水平与附加染色体的供体油萝卜相当，而其它8个附加系的自交后代未表现出抗性，与受体油菜相近。【结论】油萝卜的9条染色体分别附加到油菜中后，其遗传稳定性因附加的染色体而异，有的能稳定遗传，有的在自交后代中丢失1或2条；抗甜菜胞囊线虫的基因在d染色体上。     

云南省水稻稻瘟病菌无毒基因AVR-Pia变异及水稻抗性基因Pia的有效性

为进一步了解田间稻瘟病菌Magnaporthe oryzae群体中AVR-Pia基因的分布及变异,利用水稻单基因系IRBLa-C水稻品种对自云南省13个市(州)采集分离得到的471株稻瘟病菌菌株进行抗性基因Pia有效性测定;利用无毒基因AVR-Pia特异性标记对471株稻瘟病菌菌株进行PCR检测和测序,并分析稻瘟病菌群体中无毒基因AVR-Pia的分布及DNA结构变异;利用有效性结果和PCR检测结果对471株菌株进行反应型划分,筛选鉴定菌株;利用鉴定菌株对云南省112份地方稻种进行Pia基因鉴定。结果表明,在471株稻瘟病菌菌株中,对含有Pia基因的水稻单基因系IRBLa-C表现为抗病和感病的菌株数分别为139株和332株,所占比例分别为29.5%和70.5%;在471株稻瘟病菌菌株中,分别有244株和227株菌株含有无毒基因AVR-Pia和不含有无毒基因AVR-Pia,所占比例分别为51.8%和48.2%,无毒基因AVR-Pia主要为完全缺失变异;在471株稻瘟病菌菌株中,A-和V+反应型菌株数分别为56株和161株,共217株,占总菌株数的46.1%,在13个市(州)稻瘟病菌群体中,A-和V+反应型菌株所占比例差异较大,其中在普洱市、红河哈尼族彝族自治州、昭通市、玉溪市4个市(州)的比例较大,分别为77.8%、57.1%、52.1%和50.0%;在112份云南省地方稻种质资源中,有20份地方稻品种含有抗性基因Pia,主要分布在9个市(州)中。表明云南省13个市(州)绝大部分水稻产区水稻Pia基因已丧抗性,含Pia基因的水稻种质在云南省分布较广。     

氮胁迫条件下稻瘟病菌分泌蛋白致病性分析

 以CH-63和TH-162个致病性差异的稻瘟病菌株为材料,在缺氮培养条件下进行液体培养。经培养2 d后,采用铵盐沉淀及透析纯化处理获得稻瘟病菌培养滤液中的分泌蛋白。分别采用致伤接种及浸泡处理对该蛋白作用水稻植株后的病理反应进行系统研究,结果表明经致伤接种的水稻叶片及茎杆接种斑处出现明显的坏死病斑,其病斑直径是对照的2~4倍。浸泡处理的水稻幼根出现严重褐化,植株生长矮小,株高仅为对照的1/2。对上述稻瘟病菌株分泌蛋白进行酶解处理后病症消失或减弱,进一步确证其为引起上述病理反应的主要因子。将该分泌蛋白接种24个水稻单基因系,接种后72 h根据病斑长度将24个IRRI水稻单基因系按抗、中、感病性状分组。对稻瘟病菌菌株CH-63和TH-16的缺氮分泌蛋白致病力强弱差异与菌丝块接种结果进行比较,结果表明CH-63致病力强于TH-16。     

稻瘟病菌产孢遗传规律分析

对稻瘟病菌三个杂交组合及一个回交组合的约２１０个单孢菌株的产孢力进行测定，明确产孢力的变异是连续性的，是由多基因控制的数量性状。稻瘟病菌产孢力平均值约为５．０４，个体产孢多少主要取决于控制该性状的基因在其内的聚集情况。     

禾谷镰刀菌和稻瘟病菌基因组中的微卫星序列比较

利用禾谷镰刀菌Fusarium graminearum和稻瘟病菌Magnaporthe grisea基因组测序结果,对这两种植物病原真菌基因组中的微卫星(SSR)序列进行了系统地分析和比较.结果表明,在禾谷镰刀菌基因组中,共发现4679个SSR序列,总长度为96.2kb,占基因组全长的0.27%.平均7.7kb碱基中有一个大于15 bp的SSR序列.在稻瘟病菌基因组中共发现16398个SSR系列,其总长度达到330kb,约占整个基因全长的0.85%,平均2.36kb碱基中就分布有1个SSR序列.在禾谷镰刀菌基因组中,数量最多的是五碱基重复序列,其次是六碱基重复序列;稻瘟病菌基因组中数量最多的是单碱基重复序列,其次为三碱基重复序列和五碱基重复序列.两基因组中数量最少的都是二碱基重复序列.尽管这两种植物病原真菌都属子囊菌,基因组大小也十分接近,但无论是在SSR的总体数量上,还是在各类SSR的分布上,两种植物病原真菌都存在十分显著的差别.     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析*

 利用信号肽分析软件SignalP v3.0,亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1.01,GPI-锚定位点软件big-PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2.0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为78bp,最大值为7849bp,平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15～45个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述,主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类,提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析

利用信号肽分析软件SignalP v3．0，亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1．01，GPI-锚定位点软件big—PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2．0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框（ORF）最小值为78bp，最大值为7849bp，平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15—45个氨基酸之间，平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述，主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类，提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

云南省六个水稻产区稻瘟病菌三个无毒基因的组成及其致病型

为明确水稻抗性基因Piz-t、Pib和Pii的有效性,利用无毒基因AvrPiz-t、AvrPib和Avr-Pii的特异性引物对自云南省6个水稻产区采集并分离获得的348株稻瘟病菌Magnaporthe oryzae菌株进行PCR扩增检测,并测定其对仅含Piz-t、Pib和Pii基因的水稻抗性单基因系IRBLzt-T、IRBLb-B和IRBLi-F5品种的致病性,明确这3个无毒基因在云南省水稻产区组成及分布。结果表明,在348株稻瘟病菌菌株中,分别有51.7%、46.8%和15.8%的菌株含有无毒基因AvrPiz-t、AvrPib和Avr-Pii,GT8、GT2、GT5、GT6、GT1、GT3、GT4和GT7基因型菌株检测频率分别为24.7%、21.8%、21.0%、16.7%、4.9%、4.0%、3.4%和3.4%;分别有4.9%、29.2%、41.1%和24.7%的菌株含有3、2、1和0个无毒基因;云南省稻瘟病菌群体总多样性指数水平较高,为2.81,其中滇中水稻产区的最高,为2.97;在348株稻瘟病菌菌株中,分别有89.1%、63.2%和38.5%的菌株对单基因系IRBLzt-T、IRBLb-B和IR‐BLi-F5表现为不致病,表明对Piz-t基因和Pib基因的抗性利用价值较Pii基因高;PT1、PT2、PT3、PT4、PT5、PT6、PT7和PT8致病型菌株检测频率分别为23.0%、30.2%、8.9%、2.0%、21.8%、5.2%、4.6%和4.3%,其中PT2、PT1和PT5为云南省稻瘟病菌的主要致病型。表明云南省6个水稻产区稻瘟病菌3个无毒基因的分布及组成差异较大,群体多样性水平较高。     

云南省稻瘟病菌生理小种演变及稻种资源垂直抗性基因的利用

１９９３～１９９７年从云南省３２个县（市）采集、分离到８００余个稻瘟病菌分生孢子单孢菌株。从中选出来自２１个县（市）的１５５个菌株,用日本鉴别品种鉴定,结果可分为７８个生理小种,出现频率最高的为１３６．４（出现频率６．５％）,较高的有３１７．４（５．２％）、００７（５．２％）、１３７．４（４．５％）、００３（３．２）、００７．５（２．６％）。稻瘟病菌的致病谱比１９８３～１９８８年的上种有了明显增强,这主要是由于栽培了抗病较强的水稻品种的原因。根据生理小种在各稻作区的组成和分布,评价了稻种资源垂抗基因在各稻作区的利用价值。     

5个稻瘟病抗性基因在云南水稻育种中的利用分析

为明确Pi9等5个抗稻瘟病主效基因在云南省抗稻瘟病育种中的利用状况,明确种质资源携带的抗性基因,本研究用4个分子标记对云南省80年代以来育成的60个推广品种和23份优异地方稻种的Pik-h、Pi2、Pi9、Pi5抗稻瘟病基因进行了分子检测,并对抗稻瘟病基因Pita第二编码区功能位点碱基进行了测序分析。结果表明:Pik-h、Pi5、Pita在地方品种中出现频率比较高,分别为65.22%、52.17%和43.48%,而Pi9和Pi2极少或未出现;现代育成推广品种中Pik-h、Pi5、Pi9、Pita频率分别为70%,38.33%,33.33%和11.67%,仅1个品种携带Pi2基因;一个品种一般携带5个基因中的0~3个;根据基因组合,可将83个品种归为14种基因型,现代育成品种具有14种,其中Pik-h、(Pik-h)-Pi5、(Pik-h)-Pi9等组合是优势类型;地方品种具有14种基因组合中的9种,2000年后审定品种中不携带或只携带1个基因的品种比例有所增加,且集中在Pik-h,比例高达此类品种的57.89%,抗性基因单一化严重,易造成成批品种抗性丧失。